БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.

1. Генетические линии животных.

Большая роль в исследовании проблем генетики человека и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирующими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также наличие большого числа консервативных групп сцепления с идентичным расположением генов наряду с возможностями использования очень мощных экспериментальных подходов для идентификации и клонирования генов линейных животных позволяют проводить параллельные исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.Для многих моногенных заболеваний человека животные,несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а зачастую и единственными моделями для исследования молекулярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лечения, в том числе и с применением методов генной терапии. Поиск таких биологических моделей, прежде всего, ведется, среди уже существующих генетических линий животных с установленным типом наследования определенных аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является доказательство идентичности мутантных генов и, соответственно первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных животных.

В различных питомниках мира, в том числе и в России,созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков до несколько сотен генетических линий различных экспериментальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Конюхов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее многочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости,удобства содержания, относительной легкости экспериментального манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые из этих линий представляют собой случайные находки, другие,а их большинство, получены в результате действия различных мутагенных факторов. Так, значительное число биологических моделей было получено путем биохимической селекции потомства мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз-мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия,почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ получения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой случайности и не позволяет направленно менять структуру нужного гена.

Процесс создания подобных генетических линий обычно включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ наследования этих фенотипческих признаков; длительное близкородственное разведение отселектированных особей. При моногенном наследовании такие линии могут либо целиком состоять из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерозиготных особей в случае сниженной жизнеспособности и нарушения плодовитости у гомозигот.

На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо моногенного наследственного заболевания руководствуются сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом мутантных животных. Однако, одного этого сходства недостаточно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть доказать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические изменения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследуются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели наследственных болезней известны и достаточно полно изучены для многих других экспериментальных и домашних животных.Представляется удивительным, что, несмотря на большое сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первичной структуре и тождественных по функциям структурных генов,для значительной части наследственных болезней человека генетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Конюхов, 1969).

Это ограничение в настоящее время может быть преодалено путем целенаправленного конструирования генетических модельных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволовых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генетческим изменениями и пересадку их в зародыши или в соматические ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных генов in vivo и оценки их биологического действия особенно удобными оказались трансгенные животные.

Раздел 2. Трансгенные животные.

Трансгенных животных получают в результате искусственного введения - трансгеноза, чужеродного генетического материала, представляющего из себя фрагмент гена или иную последовательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными экспериментальными системами для исследования молекулярно-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чужеродного гена, оценки его биологического действия на организм, а также для производства различных манипуляций со спе-цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколько способов получения трансгенных животных. Исторически более ранним и широко применяемым до настоящего времени является микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро оплодотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи микроманипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дробления случайным образом интегрирует в один из сайтов какой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интеграция может происходить в разные хромсомные сайты и число интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может значительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку трансплантируют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что подобный механический вариант трансфекции чужеродных генов на ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, используя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрессию введенного гена анализируют путем идентификации специфических мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в различных тканях трансгенного животного.Другой, более более прогрессивный способ получения трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвергается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые клетки , которые затем трансплантируют в полость бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преимущества в плане генетического моделирования подробно рассмотрены в разделе 4.