Конструированию генетических моделей должны предшествовать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологичных генов - гена человека, вследствие нарушения работы которого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта моделирования, в первую очередь, руководствуются методическими возможностями экспериментального манипулирования с животными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирования генетической линии животных с мутациями в заданном гене предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмбриональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомбинантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и отбором клонов со специфическими генетическими модификациями;(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения химерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)инбредное разведение и селекцию гомозигот.

Как упоминалось ранее, идеальной системой для направленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмбриональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей. При выращивании на питательном слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недифференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель (полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и могут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В результате образуется животное - химера, состоящее из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь поперечную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, независимым образом полученные в результате введения в одинаковые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво передавать своим потомкам генетическую информацию, содержащуюся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми трансмиттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть потомков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом типе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, искусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по заданной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном состоянии у животных этого вида.Возможность вести селекцию нужных мутантных или трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в качестве клеточных векторов нашло широкое применение в генетическом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обрабатывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отбирали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Нихана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генетического моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомологичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомбинантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит интеграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК может быть повышена при использовании линейных плазмид и специальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмид или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего в качестве маркера используют прокариотический ген neo, сообщающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418, содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток будут в этих условиях деградировать.

Раздел 5. Методы направленного переноса генов.

Наиболее важным шагом на пути искусственного получения мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако, случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы некоторые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у человека. Однако, в любом случае схемы направленной модификации генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые направленная сайт-специфическая модификация была выполнена также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделирующая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у человека(Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в первую очередь, обусловленсуществованием простых схем отбора клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсерцией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифицируются - .В настоящее время предложено несколько вариантов для направленного переноса неселектируемых генов за счет дополнительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого маркерного гена в таком положении, при котором его экспрессия происходит преимущественно при правильном встраивании векторной последовательности в ген-мишень. Так,маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться только находясь под контролем какого-либо другого промотора хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомологичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На этом же принципе основано использование генетических конструкций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридизации, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной последовательности, расположенный вне направленно переносимого участка экзогенной ДНК.Особенно перспективным на сегоднешний день представляется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Метод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбинации HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противогерписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться гибелью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу.