Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".

Получение эритроцитов. Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови по методу Бейтлера с незначительной модификацией. [14] Сначала гепаринизированную кровь отстаивали дважды в растворе PBS, содержащем 3% декстран Т –500, в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке, пропуская ее через колонку с HBS-целлюлозой, после чего эритроциты ценрифугировали при 3000 оборотах в минуту. Далее из полученной очищенной массы эритроцитов проводили выделение мембран.

Выделение мембран. Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали осмотическим шоком по методу Dodge с небольшой модификацией, заключавшейся в том, что гемолиз эритроцитов и отмывку "теней" проводили двукратно в 10 мМ Na – фосфатном буфере с добавлением ингибитора протеназ PMSF. После этого мембраны эритроцитов лиофилизировали и хранили при -20°С.

Одномерный электрофорез по Лэммли. Электрофорез в присутствии ДДС проводили модифицированным методом методом Лэммли. [14] Для этой цели использовали следующие растворы:

1. 60% акриламид –0,8% метилен бисакриламид.

2. Буфер для разделяющего геля: 1 М трис – HCI (pH 8,8).

3. Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис – HCI (pH 6,8).

4. 10% додецилсульфат натрия.

5. 10% персульфат аммония.

6. ТЕМЕД.

7. Электродный буфер для ЭФ: 0,025М трис, 0,193М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия.

Растворы хранились при +4°С две-три недели. Раствор 5 готовился перед использованием.

Электрофорез проводили в пластинах ПААГ размером 180х180х1мм, приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида 5 - 25%.

Для приготовления одной пластины ПААГ брали: 0,85 мл раствора 1, 5,5 мл дистиллированной воды, 3,6 мл раствора 2, 101 мкл раствора 4, 5 мкл раствора 6 и 20 мкл раствора 5 (легкий раствор, 5%). В тяжелом (25%) растворе в отличие от легкого бралось 4,2 мл раствора 1 и 2,6 мл дистиллированной воды. Через смеситель эти растворы подавались перистальтическим насосом в формирователь пластины, в течение 10 минут заполняя пластину на 4 см ниже верхнего края. Сверху на полимеризующуюся смесь наслаивалось 0,5 мл дистиллированной воды. Так формировался разделяющий гель. Полимеризация продолжалась в течение 30-40 минут. После полимеризации воду удаляли и заливали раствор, формирующий концентрирующий гель. Для приготовления такого раствора брали 660 мкл раствора 1, 100 мкл раствора 4, 2,5 мл раствора 3, 4 мкл раствора 6, 70 мкл раствора 5 и 6 мл дистиллированной воды. Вставляли формирователь лунок и наслаивали 0,3 мл дистиллированной воды. Полимеризация продолжалась в течение 20 минут, после чего пластины ПААГ могли храниться при =4°С в течение двух суток.

Подготовка проб Для приготовления анализируемого образца для ЭФ брали 1 мг лиофилизированных мембран эритроцитов и растворяли в 40 мкл уравновешивающего буфера, в состав которого входили:

(на 10 мл уравновешивающего буфера)

1. 3 г мочевины;

2. 0,2 г ДДС;

3. 1,25 мл раствора 3;

4. 0,5 мл меркаптоэтанола;

5. 5 мкл красителя бромфенолового синего.

Уравновешивающий буфер хранили при температуре -20°С в течение месяца.

Подготовленные таким образом анализируемые образцы стояли в течение одного часа при комнатной температуре, после чего их вносили объемом 15 мкл в сформированные в концентрирующем геле лунки.

Электрофорез проводили при силе тока 35 мА, пока напряжение не возрастало до 300 В, затем стабилизировали источник питания по данному напряжению и проводили ЭФ этом режиме, пока лидирующий краситель не доходил 1 см до края пластины.

После ЭФ фореграммы окрашивали в течение одного часа красителем Кумасси G - 255 по модифицированной методике Fairbanks в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты, 25% изопропанола, 0,05% кумасси голубого. После этого несвязавшуюся краску отмывали в течение 12 часов 10%-ной уксусной кислотой до полного исчезновения фонового окрашивания.

Отмытые фореграммы затем дегидратировали в течение 30 минут в растворе, содержащем 280 мл изопропанола, 25 мл глицерина и 195 мл дистиллированной воды. Далее пластины ПААГ плотно фиксировали между двумя слоями целлюлозной бумаги и в натянутом виде высушивали при комнатной температуре.

На электрофореграммах идентифицировали 17 белковых фракций.

Денситометрирование. Денситометрирование электрофореграмм проводили на лазерном денситометре «Ultrascan XL». Молекулярную массу белков определяли с помощью маркерных белков с известной молекулярной массой: бычий сывороточный альбумин (Mr=68 kD), овальбумин (Mr=43 kD), химотрипсиноген (Мr=25 kD), миоглобин (Мr=17,5 kD) и цитохром (Мr=12,4 kD).

Определение концентрации белка. Содержание белковых фракций в исследуемом образце определяли по известной массе маркерного белка бычьего сывороточного альбумина, через полученные при деситометрировании площади альбумина и каждой белковой фракции в отдельности по формуле:

m(x)=S(x)´4.5/S(a),

где m(x) – масса белковой фракции,

S(x) – площадь этой фракции под пиком на денситограмме

4.5 – масса маркерного белка альбумина в мкг,

S(a) – площадь маркерного белка альбумина под пиком на денситограмме.

Дальнейший пересчет количественного содержания белковых фракций проводили на 1 миллиграмм общего белка.

Методы статистической обработки

Статистическая обработка материала проведена на ПВМ IBM PC/AT (486) с использованием программы "Gen 1", составленной д.б.н Трубниковым В.И. и пакета прикладных программ "STATGRAPHICS v3.0".

При описании количественных признаков использовались параметры нормального распределения: среднее значение, стандартная ошибка среднего значения, несмещенная дисперсия. Для проверки статистических гипотез использовались параметрические критерии Стьюдента и Фишера. Уровень значимости принимали равный 0,05.

Кластерный анализ. При проведении кластерного анализа в качестве объектов выступали индивиды и изучаемые признаки, а мерой сходства служили коэффициенты корреляции без учета знака. Результаты кластерного анализа позволили определить соответственно некоррелированные группы изучаемых параметров, детерминирующих фенотипическую изменчивость признаков. На каждом шаге кластеризации выбирался наибольший по значению элемент матрицы, стоящий на пересечении i-й строки и j-го столбца объединения i-го и j-го признаков в кластер, рассматриваемый как новый признак. Для выделения кластера пересчитывались значения коэффициентов корреляции в матрице с тем, чтобы на следующем шаге кластеризации поиск максимального коэффициента корреляции проводился с учетом предыдущих результатов. Приведенный алгоритм кластерного анализа служил лишь для подразделения корреляционной матрицы на отдельные подсистемы без проверки статистической значимости уровней объединения кластеров. Проверка гипотезы о некоррелированности выделенных подсистем осуществлялась с использованием специальных критериев.