Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой двухцепочечной ДНК, которая способна к репликации (воспроизведению) в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом бoльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки. Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет (рис. 5, 6). Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон, директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду».

Последующие эксперименты подтвердили способность ДНК-вакцин формировать иммунитет в отношении разнообразных возбудителей.

Потенциальные преимущества ДНК-вакцин

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами.

3.2.3. Повышение эффективности и безопасности иммунизации

1. Способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных протеинов.

Если в качестве вакцины использовать иммуногенные протеины, то в процессе их производственного получения и очистки могут произойти изменения трехмерной конфигурации этих молекул. Поэтому иммунизация может быть низкоэффективной в связи с образованием антител, специфичных к измененным иммуногенным молекулам, но не к нативным вирусным протеинам. Введение ДНК-вакцин, как правило (см. «возможные ограничения в применении ДНК-вакцин»), приводит к синтезу клетками вирусных антигенов в их нативной форме.

2. Способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов.

Инактивированные или субъединичные вакцины в основном индуцируют гуморальный иммунный ответ. Это обусловлено тем, что характер механизмов представления и распознавания антигенов клетками иммунной системы зависит от того, синтезируется ли антиген в клетке или поступает в нее извне. А от этого в свою очередь зависит характер активации и взаимодействия клеток, участвующих в иммунном ответе. Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез иммунногенных белков клетками самого организма, они способствуют формированию как гуморального, так и клеточного иммунитета. Активация цитотоксических Т-клеток без введения живого патогена является важнейшей отличительной чертой ДНК-вакцин.

3. Могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-лимфоцитов.

В принципе возможна разработка ДНК-вакцин, которые избирательно активируют разные типы хелперных Т-лимфоцитов. Благодаря этому могут быть созданы генные вакцины для лечения лиц с аутоиммунными или аллергическими заболеваниями, патогенез которых связан с нарушением различных звеньев иммунной регуляции.

4. Способствуют формированию длительного иммунитета.

Как и живые аттенуированные, ДНК-вакцины способны обеспечивать иммунитет в течение длительного времени. Этим они отличаются от инактивированных вакцин, которые обеспечивают длительный иммунитет только путем проведения повторных вакцинаций.

5. Устраняют риск инфицирования.

По своему действию ДНК-вакцины напоминают живые аттенуированные вирусные вакцины или некоторые рекомбинантные вакцины на основе живых вирусных векторов, так как иммуногенные белки синтезируются в организме самого человека. Но при введении генных вакцин отсутствует опасность инфицирования человека.

3.2.4. Упрощение разработки и производства новых вакцин

1. Простота получения большого количества ДНК-патогенных микроорганизмов.

Многие микроорганизмы сложно культивировать (вирусы гепатита В и С, папилломы человека и др.), что затрудняет создание вакцин. Благодаря современным технологиям (например, применение полимеразной цепной реакции) можно получить достаточное количество ДНК практически любого патогенного микроорганизма, выделить гены, кодирующие иммуногенные протеины, и создать вакцину. Выполнение Проекта человеческого генома приведет к тому, что через несколько лет ученые будут располагать расшифрованными геномами большинства известных патогенных микроорганизмов. Это значительно облегчит задачу скрининга генов для идентификации тех из них, которые кодируют молекулы иммуногенных протеинов возбудителя заболевания. В тех случаях, когда такие гены трудно выявить, разработчики вакцин могут воспользоваться «библиотеками ДНК» соответствующих патогенов (коллекциями последовательностей комплементарной ДНК, содержащими только те участки ДНК какого-либо микроорганизма, которые кодируют продукцию белков, то есть все экспрессированные гены). Эти молекулы ДНК легко клонировать и использовать в исследованиях по созданию вакцин.

2. Возможность создания комбинированных вакцин.

В качестве комбинированных вакцин сейчас широко применяют только инактивированные вакцины, поскольку при введении нескольких аттенуированных вирусных вакцин они могут терять иммуногенность (так называемый феномен вирусной интерференции). ДНК-вакцины можно комбинировать. Это особенно важно, так как в настоящее время детям с 1-й недели жизни и до 16–18 лет выполняют не менее 18 вакцинаций. Мультивалентные ДНК-вакцины можно использовать для выработки эффективного иммунитета против паразитарных заболеваний (так как антигенные характеристики паразита могут зависеть от стадии его развития в организме человека), а также для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами микроорганизмов.