Таблица 3.

Основные характеристики генетической трансфекции in vitro

Обзор данных (табл. 3.) позволяет прийти к заключению, что несмотря на усилия многих лабораторий мира все усилия известные и испытанные in vitro и in vivo векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных in vitro успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильности интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждается в серьезных доработках.

Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов (таблица 3). Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рцептор-опосредованных систем (рис 4.), либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть, ДНК – структур, способных к длительной персистенции внутри ядер). В последнее время особое время уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом, такие мини хромосомы длительно удерживаются в клетке и способны нести полноразмерные гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена в нужной ткани и в должное время.

Глава 4. Перспективы клонирования животных

Идея клонирования животных, т.е. получение генетически идентичных копий, родилась благодаря успешным экспериментам по пересадке ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйцеклетки или ооциты, выполненным на амфибиях. Цель этих экспериментов была сугубо теоретическая - выяснить вопрос, способно ли ядро (геном) дифференцированной клетки к репрограммированию и восстановлению тотипотентности, т.е., будучи помещенным в цитоплазму яйца, способно ли оно обеспечить полное развитие подобно оплодотворенной яйцеклетке. Фактически речь шла о возможности обратимости эмбриональной дифференцировки и выяснению вопроса: претерпевает ли геном в процессе развития необратимые изменения или модификации? Успешные опыты J.Gurdon и его сотрудников, показавшие возможность развития взрослых амфибий из реконструированных яйцеклеток после трансплантации в них ядер из клеток эпителия кишечника плавающей личинки (головастика), были интерпретированы как убедительное доказательство, что геном дифференцированных клеток способен к репрограммированию в цитоплазме яйцеклетки и восстановлению тотипотентности, подобно оплодотворенному яйцу. Из этих результатов логично вытекало, что используя технику трансплантации ядер из соматических клеток взрослых особей в энуклеированные яйца или ооциты, можно получать генетические копии животного, служившего донором ядер дифференцированных клеток. Безусловно, клонирование животных открывало бы заманчивые перспективы для генетического копирования животных, прежде всего сельскохозяйственных, тех, которые имеют те или иные выдающиеся показатели продуктивности.

Однако первые попытки применить описанный выше подход для клонирования млекопитающих были безуспешными и даже скандальными. Сенсационные результаты Illmensee по рождению мышей, развившихся после пересадки кариопластов из разных частей предимплантационных эмбрионов мыши в энуклеированные яйца, не были подтверждены другими исследователями. Эти результаты вызвали еще большие сомнения после заявления лаборанта Illmensee, что результаты опытов Illmensee были фальсифицированы. В начале 80-х годов эксперименты по трансплантации ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйца или ооциты показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 2-го деления-дробления. Другой экспериментальный подход для изучения тотипотентности эмбрионов был основан на разделении бластомеров на ранних стадиях развития (до 16-клеточной стадии) и независимой их трансплантации приемным матерям. Результаты этих экспериментов показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 4-клеточ-ной стадии, хотя у овец такая потеря происходит на более поздней стадии развития (после 16-клеточной стадии). Открытие импринтинга и его существенной роли в развитии млекопитающих сделало еще более проблематичной возможность клонирования млекопитающих, поскольку выяснилось, что материнский и отцовский геномы имеют разный вклад в нормальное развитие эмбриона, причем эти функциональные различия родительских геномов формируются в процессе овогенеза и сперматогенеза, импринтируются и реализуются в течение всего онтогенеза.

Тем не менее, исследования тотипотентности и плюрипотентности в эмбриональном развитии продолжались с использованием новых экспериментальных подходов. Уже в конце 80-х годов стало очевидным, что ооцит на стадии М2 (второе меойтическое деление) обладает факторами, способными репрограммировать геном клеток, полученных из внутренней клеточной массы бластоцисты после их трансплантации в энуклеированный ооцит М2. Здесь следует отметить значительный вклад в разработку этой техники шотландской группы исследователей под руководством Ian Wilmut и американских исследователей Keefer, Mathews и First. В 1996 г. вышли две публикации по успешному рождению ягнят и развитию эмбрионов коров до 80-85 дней беременности в экспериментах по трансплантации кариопластов, полученных из клеток культуры эмбриональных стволовых клеток, в энуклеированные ооциты М2 (Campbell et al., 1996; Keefer et al., 1996). По-видимому, эти успехи подтолкнули Ian Wilmut и его коллег попытаться использовать в качестве доноров ядра (кариопласты) дифференцированных клеток, взятых от эмбрионов или взрослых животных. Результатом этих экспериментов явилось рождение Dolly, овцы, развившейся из ооцита М2, у которого было заменено собственное ядро на ядро клетки из культуры эпителиальных клеток, полученной из молочной железы взрослой лактирующей овцы. Вне всяких сомнений, это выдаюшийся успех в клонировании животных. Впервые предложен, хотя и сложный в техническом отношении, способ получения генетических копий млекопитающих. Несомненно также и то, что клонирование станет сильнейшим стимулом для развития нового направления в биотехнологии животных и откроет широкие возможности в селекции сельскохозяйственных животных.