2.3. АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ: Ti-ПЛАЗМИДЫ

В A. tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плазмида. Плазмида содержит Т-ДНК (transferred DNA), которая составляет 12-22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

Кроме Т-ДНК в Ti-плазмиде содержатся vir-область, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации. Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а не хромосомные гены бактерий ответственны за поддержание трансформированного состояния клеток корончатых галлов, были получены при изучении штаммов Agrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни синтеза опинов. Все полученные мутации Ti-плазмид разделяют на три основных класса. Мутанты первого класса не индуцируют синтез опинов, но вызывают образование корончатых галлов. Мутанты второго класса утрачивают способность индуцировать развитие опухолей. Мутанты третьего класса стимулируют аномальную дифференцировку нормальных клеток, например избыточный рост корней или побегов. Эти генетические исследования показали, что ДНК Ti-плазмид содержит гены, которые контролируют развитие опухолей, синтез опинов. Поскольку у растений с мутантными Ti-плазмидами второго и третьего классов с помощью фитогормонов можно стимулировать опухолеобразование, было предположено, что полученные мутации затрагивают гормональный метаболизм.

2.4. КАКИЕ ГЕНЫ ЛОКАЛИЗОВАНЫ В Т-ДНК

В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Ген iaaM 1 кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая переводит триптофан в индолилацетамид. Ген iaaH 2 кодирует гидролазу, превращающую индолилацетамид в гормон растений ауксин - индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная деятельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Изопентенилтрансфераза, кодируемая геном ipt, катализирует ранние стадии биосинтеза природного цитокинина. Гены iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, так как продуктами этих генов являются фитогормоны ауксин и цитокинин, которые индуцируют деление клеток. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лактата, который является продуктом превращения ауксина. Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект. Ген tml 6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6а необходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6б изменяет чувствительность растительных тканей к цитокинину и сохраняет клетки в недифференцированном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов.

2.5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК.

Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения. VirA является гистидиновой протеинкиназой, способной к аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG. Фосфорилированный VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин - больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется.

Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Один из них является двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы, режущей точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин.

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. Недавние результаты анализа нуклеотидных последовательностей в участках растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и наружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и углерода.

2.6. ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. Необходимо только уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры целой Ti-плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий подход. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий - Escherichia coli. E. сoli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят в клетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti-плазмид Т-ДНК со встроенным чужеродным геном включается в Ti-плазмиду, замещая нормальную Т-ДНК. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном. Последний этап заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженерными методами агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном, то есть цель работы, состоявшая во введении данного гена в геном растения, будет достигнута. Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно упростить, если использовать бинарные векторные системы, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений.