КРИСТАЛЛЫ ВРЕМЕНИ

Предположение о том, что млекопитающим присущи внутренние часы, которые ежедневно синхронизируются суточным циклом, возникло из экспериментов Мейнарда Джонсона в Гарварде

24

незадолго до второй мировой войны, но о нем скоро забыли. Лишь в 50-х годах Фрэнк Браун из Северо-западного университета и Колин Питтендрих из Принстона возродили концепции часов и захватывания (синхронизации). Идея использовать ежедневный стимул для подстройки фазы циркадианных часов родилась в диссертации Кеннета Роусона в 1956 году. Эта способность подстраивать фазу по сигналу времени – важнейшее условие полезности любых циркадианных ритмов. Роусон в своих опытах использовал млекопитающих, хотя они оказались не лучшими объектами для исследования подстройки фазы . И вскоре биологи освоили для этого другие организмы, порой экзотические, но каждый из которых давал исследователю новые возможности.

В экспериментах на одноклеточной водоросли Conyaulax было получено одно из первых, хотя до сих пор непризнанных, свидетельств четной подстройки. Одновременно или несколько раньше аналогичные данные были получены на обыкновенной плодовой мушке Drosophila pseudoobscura в лабораториях в Принстоне.

С начала ХХ века плодовые мушки стали самым подробно изучаемым многоклеточным организмом на планете. В настоящее время составлен огромный каталог ее мутантов – незаменимый инструмент в руках исследователя. Такой инструмент совершенно необходим: всякий критический эксперимент нуждается в тщательном контроле, без которого эксперимент вряд ли будет однозначным. До тех пор пока биолог-экспериментатор не поставит вопрос абсолютно точно, Природа будет отвечать уклончиво. Использование генетических маркеров позволяет создать необычайно однородную популяцию исследуемых организмов. Изучая мутантов с различными нарушениями зрения, проводя искусственный отбор линий мух с измененным периодом часов или необычной чувствительностью к температуре, биологи уже продвинулись так далеко, что выделили, клонировали и картировали гены, контролирующие развитие циркадианных часов.

Зачатие плодовой мушки происходит обычным путем. Оплодотворенное яйцо развивается, и из него вылупляется крошечная личинка. Затем в жизненном цикле всякой мухи наступает стадия, когда личинка должна превратиться в половозрелую крылатую особь. На время этого превращения насекомое укрывается в толстой коричневой капсуле – это закованное в панцирь существо называется куколкой. Внутри оболочки каждой куколки почти все личиночные органы растворяются и образуют жидкую массу, из которой заново строится тело взрослой особи. Только мозг остается неизменным, и в нем продолжают тикать циркадианные часы. Наконец, приходит срок, когда самка должна выбраться на волю, опробовать свои крылья и подыскать себе партнера. Самка раздувает на голове маленький пузырек и выталкивает «крышку-люк» – выход из оболочки. Через несколько минут она на свободе. В естественных условиях, а также в лаборатории при чередовании 12 часов света 12 часов темноты это событие – вылупление взрослой особи - происходит в первые светлые часы.

Момент вылупления задают циркадианные часы. Куколка с каждым днем все более созревает, готовясь к моменту, когда она выйдет на свет и вступит в конкурентную борьбу. Эта готовность, нарастающая изо дня в день, зависит также еще одного фактора – времени суток предпочтительного для вылупления. Мушке нет смысла появляться, когда день уже кончился или подставлять свое нежное влажное тельце зною дня. Целесообразнее всего появиться рано поутру. Это можно обеспечить внутренний ритм – повышая или понижая порог готовности.

Если изменения порога не велики, мушки все равно будут вылупляться в любое время циркадианного цикла, но в одно время с большей вероятностью, чем в другое. Если же порог изменяется в широких пределах, если в некоторые часы он поднимается быстрее, чем нарастает готовность, то в эти часы не появится ни одна мушка. В зависимости от возраста зреющей куколки она присоединяется к той или другой кучки вылупляющихся, но никогда не начнет вылупление в промежуточные часы. Появления мушек будут распределены во времени дискретными пачками – это распределение отражает работу часов, задающих ритм изменения порога.

25

У эмбрионов плодовой мушки циркадианные часы не включаются сами собой автоматически. Если с момента зачатия мушки находятся в постоянной темноте, момент вылупления определяется возрастом и совершенно не зависит от времени суток. Если популяция состоит из особей разного возраста (в пределах нескольких дней), то моменты отдельных вылуплений образуют плавное распределение, охватывающее несколько дней, без признаков ежедневного сгущения и разрежения. Но если на этапе раннего развития будет подан какой-либо сигнал времени, то через несколько дней вылупление будет происходить «кучно», раздельными пиками, отстоящими друг от друга на 24 часа. Одиночная вспышка света, например, запускает часы у всех эмбрионов. Их 24-часовой период – врожденный, генетически запрограммированный. Но у мутантов этот период может составлять, например, 19 часов.

При таких условиях содержания состояние внутренних часов чутко реагирует на малейшие вариации температуры, на самую незначительную засветку. Если личинки содержать при постоянном освещении, то оно остановит ход часов, даже если они были пущены. Оказывается, часы дрозофилы не замечают красного и желтого, – но голубой, даже такой слабый, как лунный свет, сразу подавляет циркадианные колебания. В лабораториях для этого используют яркие лампы дневного света. Если куколок, выращенных на свету, перенести в красную или желтую темноту, все часы разом, одновременно возобновят ход и будут тикать синхронно. Примерно через 17 часов наступит пик массового вылупления, потом еще через 24 и так далее, пока не созреют самые молодые куколки. Однако даже кратковременная вспышка света, прорезающая вечную ночь, способна сдвинуть все последующие пики вылупления – как будто свет вызывает подстройку внутренних часов, переводя их из какой-то старой фазы, на которую пришлась вспышка, в некую новую. Эту новую фазу легко оценить, экстраполируя последующий ритм выступлений назад, к моменту начала вспышки света.

В экспериментах с дрозофилой подстройку фазы вызывают на ранней стадии развития у куколок. Специальный аппарат, способный на протяжении нескольких недель регистрировать появление мушек, позволяет наблюдать моменты. Когда циркадианные часы оказываются в нулевой фазе (вылупление), а следовательно, вычислять фазу в любое время, поскольку период часов составляет 24 часа. Таким образом, можно установить, на сколько, например, сдвинулась фаза часов под влиянием светового импульса, приложенного за несколько дней до момента вылупления.

При первых поисках сигуляции биологических часов в экспериментах, организованных по схеме «ловушки сингулярности», было использовано более 500 чашек Петри – применялось воздействие светом разной длительности и в разное время. Постоянно регистрировалось время выступленья, а по нему оценивалась новая, подстроенная, фаза ведущего циркадианного ритма. Во всех чашках наблюдалось по несколько пиковых мушек – каждый день по одному, в одно и то же время по показаниям внутренних часов. Первый пик составили самые старшие в группе особи. Их младшим сестрам понадобилось еще несколько дней, чтобы завершить созревание и подготовиться к «выходу на свет», который состоялся по такому же сигналу того же самого циркадианного ритма.