Изменение концентрации кальция в цитоплазме может происходить по двум причинам: кальций может входить или выходить через клеточную мембрану, либо переходить из цитоплазмы во внутриклеточные органеллы и обратно, в первую очередь в эндоплазматический ретикулум (в мышце - саркоплазматический ретикулум) и митохондрии. Для измерения внутриклеточной концентрации кальция в клетку вводятся специальные вещества, такие как экворин (aequorin) или фура-2 (fura2), которые излучают или поглощают свет при связывании ионизированного кальция. Другой способ отслеживания изменений уровня кальция - трансфекция особых белковых комплексов, созданных при помощи генной инженерии таким образом, что их флуоресцентные свойства изменяются в зависимости от концентрации ионизированного кальция. В обоих случаях изменения в поглощении или излучении, пропорциональные изменениям уровня кальция, измеряются с помощью высокочувствительных оптических методов. Средняя концентрация кальция в покое для большинства нейронов составляет от 10 до 100 нМ. Уровень кальция в межклеточном пространстве позвоночных составляет от 2 до 5 ммоль.

Для поддержания низкой внутриклеточной концентрации кальция необходим механизм, осуществляющий непрерывный вывод кальция из клетки вопреки наличию значительного концентрационного градиента. Кроме того, системы кальциевого транспорта через внутриклеточные мембраны поддерживают высокую концентрацию кальция в органеллах. Так, уровень кальция в эндоплазматическом ретикулуме может достигать 400 мкмоль, а в саркоплазматическом ретикулуме мышцы поднимается до 10 ммоль. Молекула, ответственная за транспорт кальция через плазматическую и цитоплазматическую мембраны, называется кальциевая АТФаза. Еще один механизм транспорта кальция будет обсуждаться ниже в этой главе.

АТФазы зндоплазматического и саркоплазматического ретикулумов

Одно из семейств АТФаз расположено в мембране эндоплазматического ретикулума нейронов, а также в саркоплазматической мембране скелетной мышцы. Эти АТФазы переносят ионы кальция из цитоплазмы во внутриклеточные органеллы. Сокращение мышечного волокна происходит при освобождении кальция из саркоплазматического ретикулума в миоплазму. Быстрое устранение ионов кальция из миоплазмы, необходимое для релаксации мышцы, обеспечивается за счет высокой концентрации АТФаз в мембране саркоплазматического ретикулума.

Кальциевый транспортный цикл в принципе аналогичен циклу работы натрий-калиевого насоса. Он начинается с присоединения двух ионов кальция к местам связывания, расположенным в цитоплазме и обладающим высоким сродством к кальцию (Km (Ca) ~ 100 нМ) Затем происходит фосфорилирование фермента и изменение его конформации, в результате чего ионы кальция переносятся внутрь ретикулума. После освобождения кальция молекула АТФазы дефосфорилируется и возвращается в свое первоначальное состояние.

АТФазы плазматической мембраны

Кальциевые АТФазы встречаются также в плазматической мембране любой клетки. За исключением некоторых деталей, строение и функция этих АТФаз не отличается от кальциевых АТФаз эндоплазматического и саркоплазматического ретикулумов. Внутриклеточное место связывания обладает высоким сродством к кальцию, однако во время транспортного цикла происходит связывание всего одного иона кальция. Концентрация АТФаз в плазматической мембране нейронов и мышечных клеток довольно низка, поэтому эффективность этой транспортной системы не слишком высока. Тем не менее, с задачей устранения входящего в клетку кальция она справляется.

Натрий-кальциевый обменник

Во многих механизмах ионного транспорта используется совершенно иной принцип переноса ионов через мембрану против электрохимического градиента. Вместо энергии расщепленной молекулы АТФ эти механизмы используют энергию уже существующего перемещения ионов натрия в направлении их концентрационного градиента, то есть внутрь клетки.

Один из примеров - натрий-протоновый обменник, переносящий ионы в соотношении 1: 1 и участвующий в поддержании внутриклеточного рН. Протоны переносятся из клетки наружу вопреки электрохимическому градиенту в обмен на ионы натрия, перемещаемые внутрь клетки.

Подобным же образом переносятся кальций, калий, бикарбонат и хлор. В результате работы этих вторичных транспортных механизмов, в состоянии покоя внутрь клетки попадает значительное количество натрия. Тем более важна роль натрий-калиевых обменников, выводящих натрий обратно во внеклеточную среду.

В некоторых случаях механизмами вторичного активного транспорта используется энергия перемещения ионов калия в направлении их электрохимического градиента.

Транспортные системы натрий-кальциевого обмена

Существуют по крайней мере два механизма натрий-кальциевого обмена. Наиболее часто встречаются обменники типа NCX (Na-Са exchange), которые были впервые описаны в сердечной мышце, нерве краба и аксоне кальмара. При переносе транспортной молекулой одного иона кальция наружу происходит перенос трех ионов натрия внутрь клетки. Несмотря на то, что сродство NCX к кальцию ниже, чем у кальциевой АТФазы, общая мощность этого транспортного механизма выше приблизительно в 50 раз, поскольку плотность таких молекул в мембране значительно выше. NCX играют важную роль в условиях повышенного входа кальция в клетку, вызванного электрической активностью и превышающего возможности АТФаз по устранению избыточного кальция из клетки.

Для измерения внутриклеточной концентрации кальция использовали флуоресцентную молекулу экворин (aequorin). В состоянии покоя вход кальция в направлении электрохимического градиента уравновешивается за счет переноса ионов из клетки ионным обменником. В начале опыта внутриклеточная концентрация кальция высока потому, что уровень кальция снаружи аксона повышен (112 ммоль).

При снижении внеклеточной концентрации снижается и пассивный вход кальция в аксон. В результате снижается внутриклеточная концентрация кальция, и движущая сила для этого иона возрастает до тех пор, пока скорость пассивного тока вновь не сравняется со скоростью выброса кальция.

С другой стороны, снижение внеклеточной концентрации натрия приводит к увеличению внутриклеточной концентрации кальция, поскольку обменник медленнее выводит кальций в условиях сниженной движущей силы для натрия.

Поэтому происходит повышение внутриклеточного уровня кальция, снижающее скорость входа кальция в клетку. Замена ионов кальция ионами лития, не способными участвовать в работе обменника, приводит к дальнейшему повышению внутриклеточной концентрации кальция.

Реверсия направления работы NCX

Изменение градиентов для одного или нескольких ионов, участвующих в работе обменника, может привести к перемене направления его работы. Интересно, что в случае NCX такая смена направления может произойти в физиологических условиях. При этом кальций будет переноситься внутрь клетки, а натрий - выводиться из нее. Направление работы NCX определяется разницей между энергией, выделяемой при перемещении трех ионов натрия внутрь клетки, и энергией, необходимой для переноса одного иона кальция наружу. Одним из факторов, определяющих этот энергетический баланс, является мембранный потенциал. Влияние потенциала мембраны обусловлено тем, что процесс ионообмена не является электрически нейтральным. Вследствие каждого прямого цикла работы обменника, через мембрану внутрь клетки переносится один положительный заряд. Следовательно, гиперполяризация мембраны облегчает прямой цикл обменника, в то время как деполяризация его затрудняет и может привести к изменению направления, то есть к работе обменника в режиме обратного цикла. Следует подчеркнуть, что, несмотря на отсутствие электрической нейтральности, обменники не являются электрогенными. В отличие от насосов, они работают за счет электрохимических градиентов, а не производят их.