Для предотвращения ошибок, связанных с «концевыми эффектами», желательно при анализе библиотеки, полученной на основе частичного гидролиза геномной ДНК, вводить ту же рестриктазу и в анализирующую рестрикционную систему. Так, например, частичная 5а «ЗА1-библиотека, анализируемая с помощью mdIII и Sa «3AI, не будет давать артефактов. Что касается космидных клонов, у которых фингерпринтные картины могут состоять из 20–30 полос, это требование необязательно, однако при картировании клонов концевые эффекты вызывают серьезные затруднения.

1. Подберите необходимые условия для частичного гидролиза. Выберите четыре варианта усиления жесткости обработки так, чтобы получались фрагменты требуемого размера.

2. Гидролизуйте 4 аликвоты по 40 мкг свежеэкстрагированной ДНК. Образцы заморозьте.

3. Перед проведением препаративного электрофореза сравните небольшое количество образца с K/Hindlll-маркерами, проведя электрофорез в 150 мл 0,3%-ного агарозного геля HGT ТАЕ, 1 В/см в течение 16 ч. Для корректного измерения размеров фрагментов все последующие определения должны быть проведены в тех же условиях.

4. После требуемого гидролиза объедините аликвоты ДНК, проведите фенольную экстракцию и спиртовое осаждение.

5. Растворите в 180 мкл раствора ТЕ. Добавьте 60 мкл неде-натурирующего красителя, нанесите в 16 лунок 0,4%-ного агарозного геля LGT ТАЕ.

6. Нанесите в качестве маркеров ТП и интактную ЯДНК- В препаративном геле это не укажет вам точно размеры фрагментов, но поможет аккуратно отрезать полоски геля. Проведите электрофорез в течение 20 ч при 1 В/см и окрасьте гель бромидом этидия.

7. Результат электрофореза вы можете увидеть, поместив гель под длинноволновую ультрафиолетовую лампу. Отрежьте полоски по 2 мм шириной от всех 16 дорожек для отделения гидролизованного материала.

8. Расплавьте агарозный гель, нагревая в течение 10 мин требуемые образцы при 68°С в пластиковых пробирках. Проведите фенольную экстракцию, сконцентрируйте изобутанолом до 0,3 мл, переосадите спиртом и проанализируйте фрагменты, как указано выше. 9. Проведите повторно препаративный LGT-гель-электрофорез для очистки выбранной вами фракции, экстрагируйте ее из требуемой полоски геля и окончательно проанализируйте минимальную аликвоту в аналитическом варианте. Ожидаемый выход –2–4 мкг ДНК из 160 мкг материала. 10. Растворите в 20 мкл ТЕ.

Смеси для упаковки космид

В продаже имеется большое количество упаковочных смесей, но из соображений экономии можно готовить их самим. Для этих целей мы с успехом использовали штаммы Escherichia coli: NS428 и NS433. Упаковочные смеси, полученные нами, позволяли получить до 106 космидных рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК-

Получены сведения, что Есо К-активность в упаковочных смесях может влиять на репрезентативность Я-библиотек, однако нет данных, что это возможно и для космидных. Имеются в продаже коммерческие Есо К-упаковочные смеси.

Соединение фрагментов с вектором

Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.

1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.

2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.

3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.

4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.

5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.

Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.

Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 105–106 рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Заключение

В настоящее время около 90% генома С. elegans клонировано в космидах. Количество клонов, благодаря космидным стыковкам упало с 900 до 700 и снизилось еще при использовании YAC-стыковок. Одна треть кажущихся разрывов между космидными цепочками на самом деле представляет собой еще невыявленные небольшие петли; существует большое количество реальных разрывов, для которых космидные клоны очень редки или недоступны для получения. В этом случае многие исследователи надеются решить проблему с помощью больших цепочек. Мы осознаем всю важность и актуальность скорейшего заполнения разрывов.

Наш опыт подсказывает, что использование космид для картирования геномов эукариот не лишено недостатков, хотя этот метод оказался очень удачным, по крайней мере для одного прокариота. Весьма вероятно, что быстрое заполнение разрывов в карте будет обеспечено методом YAC. Скорее всего, удастся получить Я-клоны, необходимые для более точного заполнения брешей в космидной карте.

Прописи растворов

1. ТЕ: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА.

2. 10X лигазный буфер: 0,5 М трис-HCl рН 7,4, 0,1 М MgCl2.

3. 10X средне-солевой рестрикционный буфер: 500 мМ NaCl, 100 мМ трис-HCl рН 7,4, 100 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотрейтола.

4. 10 X ТВЕ в г/л: 108 г. трис-основания, 55 г. борной кислоты, 9,3 г ЭДТА.

5. 50 X ТАЕ: 242 г. трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0, вода до 1 л.

6. 4%-ный денатурирующий гель: 480 г. мочевины, 38 г. акриламида, 2 г бисакриламида, воды примерно 800 мл. Растворить при незначительном нагревании. Добавить 20 г. смолы Амберлит МВ-3, медленно перемешивать 1 ч. Профильтровать через стеклянный фильтр N2. Добавить 100 мл 10х ТВЕ и воды до 1 л.

7. Краситель с формамидом: 100 мл деионизованного формамида, 0,1 г ксиленцианола FF, 0,1 г бромфенолового синего, 0,3 г ЭДТА.

8. Прокипяченная РНКаза: 100 мг РНКазы А, 10 мл 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 15 мМ NaCl. Инкубировать при 100°С 15 мин. Охладить, разлить по пробиркам, хранить образцы при –20°С.

9. 2Х TY-среда в г/л: 16 г. триптона, 10 г. дрожжевого экстракта, 5 г NaCl. Довести рН до 7,4. 10. CY-среда в г/л: 10 г. казаминокислот, 5 г дрожжевого экстракта, 3 г NaCl, 2 г КС1. Довести рН до 7,0.

11. 20Х SSPE: 104 г. NaCl, 15,6 г NaH2P04X2H20; 3,7 г ЭДТАх2Н20; 25 мл 4 М NaOH и воды до 500 мл.

12. Буфер для разведения фага К: 10 мл 1 М трис-HCl рН 7,4, 5 мл 1 М MgS04, 11,7 г NaCl, 1 г желатины, воды до 1 л.