2. Репликация рнк с образованием днк

а. Репликация геномов ретровирусов

Геном ретровирусов представлен единственной молекулой одноцепочечной РНК. После проникновения РНК в клетку хозяина вирусный геном подвергается обратной транскрипции, при этом сначала образуется дуплекс РНК-ДНК, а затем двухцепочечная ДНК. Эти этапы предшествуют экспрессии вирусных генов на уровне белков и образованию РНК-геномов.

Фермент, катализирующий комплементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной транскриптазой. Он содержится в ретровирусных частицах и активируется после попадания вируса в клетку и разрушения его липидно-гликопротеиновой оболочки. Вполне вероятно, что обратной транскрипции способствуют какие-то вспомогательные белки, находящиеся внутри вирионов, поскольку в присутствии последних ферментативная реакция протекает гораздо эффективнее и быстрее, чем в присутствии очищенного фермента. Появляется все больше данных о том, что обратная транскрипция происходит в самых разных эукариотических клетках, а обратная транскриптаза играет важную роль в процессах перестройки генома

Обратные транскриптазы ретровирусов по существу являются ДНК-полимеразами, и in vitro могут использовать в качестве матрицы ДНК. Однако гораздо эффективнее они работают, если матрицей является РНК. Как и все ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы не способны инициировать синтез новых цепей ДНК. Но если синтез уже инициирован с помощью праймерной РНК или 3'-концево-го участка ДНК, то фермент эффективно осуществляет синтез, используя цепь ДНК как матрицу.

Ретровирусы - это диплоидные организмы, поскольку каждый вирион содержит две идентичные цепи РНК размером от 8000 до 10000 нуклеотидов. Цепи соединены вблизи своих 5'-концов, однако природа этого нековалентного взаимодействия неизвестна. Области 5' - и 3'-концов обеих цепей модифицированы, как и у всех эукариотических мРНК. Рассматривая механизм обратной транскрипции, необходимо отметить наличие пяти структурных элементов у вирусной РНК:

1) прямые повторы на 5' - и 3'-концах РНК;

2) последовательность из 80-120 нуклеотидов, соседствующая с 5'-концевым повтором;

3) последовательность из 170-1200 нуклеотидов, соседствующая с 3'-конце-вым повтором;

4) последовательность из 15-20 нуклеотидов, в пределах которой клеточная тРНК спаривается с ретровирусной РНК, что создает праймер для синтеза первой цепи ДНК;

5) сегмент Ри, находящийся непосредственно перед повтором U3 и являющийся сайтом для праймирования второй цепи ДНК; такой сегмент одинаков у РНК всех ретровирусов определенного типа.

Известны три продукта, образующиеся в результате обратной транскрипции: форма А - линейный дуплекс ДНК с последовательностью U3RU5, имеющийся на обоих концах дуплекса; два кольцевых дуплекса ДНК, производных формы А; форма В с LTR-повторами на обоих концах и форма С только с одним LTR. Объяснить образование структур А, В и С при обратной транскрипции вирусной ДНК весьма непросто. Процесс начинается с наращивания тРНК-праймера на матрицах U5 и R в направлении 3' - >5'. Затем РНКаза Н, специфичная к РНК в составе гибридного РНК-ДНК-дуплекса, расщепляет сегмент РНК этого дуплекса. Поскольку на 3'-конце РНК имеется повтор R, новосинтезированная короткая цепь ДНК "перепрыгивает" на этот конец молекулы мРНК и спаривается там с комплементарным ей участком. Далее происходит удлинение цепи ДНК с использованием в качестве матрицы остальной части мРНК. К моменту завершения синтеза первой цепи ДНК большая часть вирусной ДНК разрушается РНКазой Н. Затем в предполагаемом сайте связывания праймера вблизи повтора U3 инициируется синтез второй цепи ДНК с использованием новосинтезированной первой цепи в качестве матрицы. Праймером для синтеза второй цепи может быть РНК, однако как идет синтез второй цепи - непрерывно или прерывисто - неизвестно. После репликации тРНК-связывающей последовательности на 5'-конце первой цепи ДНК тРНК, по-видимому, удаляется. Затем новосинтезированная вторая цепь ДНК спаривается с тРНК-связывающей последовательностью первой цепи. После удлинения 3'-концов каждой цепи завершается образование дуплекса ДНК. Обратите внимание, что на каждом конце ДНК-дуплекса имеется прямой повтор последовательности U3RU5 - LTR. Кольцевые ДНК, по-видимому, образуются либо путем лигирования концов линейной ДНК, либо путем гомологичной рекомбинации между сегментами LTR. Удивительно, что такая сложная последовательность реакций протекает без явного участия ферментов репликации клетки-хозяина. Репликация двухцепочечной формы ретровирусной ДНК не начинается до тех пор, пока она не встроится в клеточную ДНК. Субстратом для такого интеграционного события является продукт обратной транскрипции - линейная дуплексная ДНК. Механизм рекомбинационного встраивания пока полностью не установлен. В результате интеграции образуется структура. При интеграции на обоих концах интегрированной вирусной ДНК утрачивается по нескольку нуклеотидов в пределах LTR-последовательностей и происходит дупликация 3-10 нуклеотидов клеточной ДНК. После интеграции ретровирусная ДНК реплицируется как часть клеточной ДНК. РНК дочерних вирионов образуется в результате транскрипции интегрированных копий вирусной ДНК. Инициация синтеза РНК происходит в крайних левых точках стыковки U3R, а терминация-в крайних правых точках стыковки RU5.

б. Некоторые ДНК-содержащие вирусы используют для репликации обратную транскрипцию

Геном вируса гепатита В человека представлен кольцевой двухцепочечной ДНК с пробелами. Если вирус находится внутри клетки, то пробелы заполняются вирионной ДНК-полимеразой. Такая почти полноразмерная цепь ДНК играет роль матрицы, на которой синтезируется РНК. Длина этой РНК равна длине генома вируса, и она играет роль мРНК в процессе экспрессии вирусных белков и роль матрицы при обратной транскрипции с образованием дочерней вирусной ДНК. Аналогичный механизм реализуется и при репликации вируса мозаики цветной капусты и других вирусов растений.

3. Репарация ДНК

ДНК - это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплементарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но и процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации. Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двухцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.

Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации. Если не принимать никаких мер, то это приведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки цитозина и аденина могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием соответственно остатков урацила и гипоксантина; частота таких событий составляет примерно 100 на геном в сутки. Если подобные нарушения в ДНК не будут устранены до следующего раунда репликации, то они могут послужить источником мутаций.