ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках. Более того, многие вирусы бактерий и животных индуцируют образование вирус-специфических ДНК-полимераз или белков, способствующих эффективному участию ДНК-полимераз клеток-хозяев в репликации вирусной ДНК. Некоторые прокариотические и эукариотические ДНК-полимеразы выделены в чистом виде, а их физические и ферментативные свойства охарактеризованы. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков.

Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I E. coli. Она представляет собой одиночный полипсптид с мультифункциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Pol I катализирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к 3'-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве дезоксинуклеотидного акцептора и матрица, детерминирующая присоединение нужного нук-леотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Pol I катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с З'-конца цепи. Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца дуплексной ДНК в направлении к 3'-концу. Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи Pol I. Если in vitro обработать Pol I трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент сохраняет ДНК-полимеразную и 3'-5'-экзонуклеазную активности; малый, N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонуклеазной активностью.

Pol I и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК E. coli.3'-5'-экзонуклеаз-ная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем Pol I, то при репликации генома часто происходят мутации - замены оснований.

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-ко-нец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей цепи. Pol I удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку Pol I способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва. этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченной ДНК.

У Е. coli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. Pol II присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Pol I, и не обладает 5'-3'-эк-зонуклеазной активностью. Следовательно, Pol II может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль Pol II в репликации и сохранении хромосомной ДНК E. coli до настоящего момента неясна.

Pol III-холофермент - это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится только 10-20 копий Pol III-холофермента, и тем не менее он является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Но поскольку Pol III-xo-лофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие Pol I, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии Pol III, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.

Обнаружены изменения в полипептидной цепи основного фермента Pol III, известны аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, а-субъединица обладает полимеразной активностью, а £-субъединица - 3'-5'-экзонуклеазной. Однако комплекс а - и £-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, 9-субъединицы пока неясна.

Помимо субъединиц, составляющих Pol III-кор, Pol III-холофермент содержит еще семь субъединиц: т, у, в, б, б', х и г|). Перечисленные полипептиды также существуют во множестве копий, так что в результате мол. масса комплекса составляет примерно 103 кДа. Роль в-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования; точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что

Pol III-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой - прерывистой отстающей.

Pol III-холофермент катализирует те же реакции синтеза, что и Pol I, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, Pol III-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. Pol III-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках, инициирующие образование праймерных РНК, обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.

ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. coli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3'-5'-экзо-нуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у некоторых ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонук-леазную реакцию коррекции ошибок, но не способна катализировать 5'-3'-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих цепей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой.