Уотсон и Крик предположили, что для удвоения ДНК должны произойти разрыв водородных связей, удерживающих вместе спиральный дуплекс, и расхождение цепей. Они также высказали мысль, что каждая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе комплиментарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской. Уотсон и Крик предполагали, что репликация ДНК осуществляется спонтанно, без участия ферментов, но это оказалось неверно. Тем не менее идея о том, что удвоение ДНК происходит путем последовательного соединения нуклеотидов в соответствии с правилом комплиментарности, заданным каждой цепью спирали, разрешила концептуальную проблему точного воспроизведения генов.

С того времени как было высказано это предположение, матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными данными, полученными как in vitro так и in vivo для различных организмов. Согласно модели репликация всех двуцепочечных ДНК полуконсервативна. Доказательство полуконсервативного механизма было получено в 1958 г. учеными Мезельсоном и Сталь(ем). Сначала они выращивали бактерий длительное время на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (15N), который включался в ДНК, а затем переносили их на среду, содержащую обычный легкий изотоп азота (14N). После репликации дочернюю ДНК первого поколения фракционировали по плотности. Оказалось, что вся дочерняя ДНК однородна и имеет плотность, промежуточную между плотностью тяжелой и легкой ДНК. Следовательно, одна цепь молекулы дочерней ДНК содержала 15N, а другая 14N, что отвечает полуконсервативному механизму. Существуют ли в природе альтернативные способы репликации двуцепочечной ДНК (консервативный и дисперсный) – неизвестно. Итак, после одно раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних ДНК является родительской, т.е. консервативной, а другая – синтезированной заново.

Репликация одноцепочечной ДНК у вирусов. Если геном представлен одноцепочечной ДНК (как у некоторых вирусов), то эта единственная цепь служит матрицей для образования комплиментарной цепи, с которой она образует дуплекс, а затем на этом дуплексе синтезируются либо дочерние дуплексы, либо одноцепочечные копии одной их матричных цепей. Репликация генетического материала вируса осуществляет обычно с участием ферментов клетки-хозяина. На некоторых молекулах вирусной ДНК синтезируются также ее ДНК-копии – с помощью либо клеточной, либо кодируемой вирусом ДНК-полимеразы. Эти ДНК-копии используются в последствии при сборке вирусных частиц. Репликация ДНК вирусов происходит либо в ядре клетки-хозяина (вирус герпеса), либо в цитоплазме (поксвирусы).

Репликация у прокариот. Редупликацию ДНК (процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-углеродом дезоксирибозы. Следовательно, к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении 5'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.

Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.

Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-полимераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 кДа, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.

Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизомеразы». (прозрачка 6) в точке начала репликации – ori (origin – начало репликации).

Структура точек начала репликации. Фрагменты ДНК, несущие точку начала репликации выделены из E.coli и некоторых плазмид, а также из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, колторую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы мало.

Итак, топоизомераза продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимераза, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)

Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-полимераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему («танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).

Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».