Культивирование. Периодическое выращивание. При периодическом выращивании следят за уровнем источника углерода и рН. Определенный исходный уровень источника углерода обусловлен токсичностью образуемых из него продуктов. Растворители, и в первую очередь бутанол, ингибируют процесс, поэтому при периодическом выращивании редко образуются более 20 кг растворителей в 1 м3. Типичные выходы для этого режима: 0,2 – 0,6 кг/м3*ч в зависимости от субстрата и условий культивирования. Для удаления конечных продуктов ферментации в качестве экстрактантов в ферментер добавляют несмещивающиеся органические растворители. Наилучшие результаты получены при добавлении олеилового спирта и смеси олеилового спирта (50%) в бензилбензоате. В обычной ферментации в периодических условиях поглощения глюкозы приблизительно 80 кг/м3. Удаление бутанола в процессе в процессе экстракции увеличило скорость его образования, и максимальная объемная производительность по бутанолу увеличилась более чем на 60% по сравнению с обычной периодической ферментацией.

Проточное культивирование. Чтобы увеличить продуктивность и снизить цены на продукты ферментации, предложено проточное культивирование.

При одностадийном проточном культивировании с низкими скоростями протока можно одновременно достигать роста клеток и максимального превращения сахаров в растворители. Но при низких скоростях разведения, благоприятных для синтеза растворителей, возникает нестабильность процесса и достичь стационарного состояния бывает очень трудно. Для промышленного применения такой проточный процесс не подходит, так как он должен быть стабильным в течение нескольких недель или лучше нескольких месяцев. Стабильность – один из важнейших критериев непрерывного процесса.

Причину нестабильности усматривают в токсичности бутанола на клетки при его высокой концентрации и во флоккуляции бактерий. Для устранения флоккуляции клеток, которая возникает в условиях высокой концентрации растворителей, рекомендовано добавление к синтетической среде солей хлора (NaCl, KCl, CaCl2).

При высокой концентрации растворителей стабильность ферментации можно улучшить в двустадийном проточной культуре: рост клеток оптимизируют в первой стадии, а продукцию растворителей – во второй.В оптимальных условиях такая конфигурация приводит к длительной стабильности на более чем один месяц, даже при высокой концентрации растворителя (21 г/л). При одностадийном проточном культивировании 20% глюкозы не используется клетками и остается в среде. В двустадийном процессе 87,5% глюкозы превращается в растворители. Комбинируя две техники: двустадийный проточный реактор и рециклирование клеток во втором ферментере, достигают как увеличенную продуктивность, так ихорошую стабильность с высокой концентрацией растворителей (17 г/л).

Проточный процесс ведут при лимитизации по фосфатам (или по сульфатам, но не по азоту или субстрату) в синтетической среде. Растворители образуются в пределах рН 4,3 – 4,7. Первая стадия – это индукция к синтезу растворителей, вторая – непосредственно образование растворителей. Поскольку фосфор почти полностью исчерпан ко времени второй фазы, рост клеток останавливается. При низкой концентрации протока выход растворителей в непрерывной культуре такой же, как в периодической: 0,29 г/г глюкозы.

При культивировании Сl. acetobutylicum в хемостате на синтетической среде с витаминами – биотином (0,01 мг/л) и р-аминобензойной кислотой (1 мг/л) – установили, что рост и образование растворителей лимитируется витаминами. продуктивность увеличивается в 4 раза приувеличении концентрации витаминов в среде. В строго анаэробных условиях выход растворителей в 1,5 раза выше, чем при доступе воздуха. В оптимальных условиях продуктивность растворителей равна ~2,0 г/л·ч.

Среды. Ферментация. Используют три типа сырья как источников углерода и энергии: зерно (крахмал), паточную (неочищенную мелассу) и очищенную мелассу. В качестве субстратов будущего рассматривают различные отходы, гидролизованную древесину, гидролизаты отбросов, сыворотку, сульфитные жидкости: гидрол – побочный продукт производства глюкозы из зерна. Среды из зернового крахмала готовят следующим образом. Мука вносится в количестве 60% к воде, туда же добавляют сброженным остаток ферментации после отгонки растворителей. Конечная концентрация должна составить 8,5% исходного зерна.

При использовании мелассы концентрация сахара должна быть 5,5-7,5%. К среде добавляют суперфосфат и аммоний. Последний вносят постепенно в случае очищенных меласс для поддержания рН на уровне 5,6–6,0 в количестве 2,2–1,3% NH3 по отношению к концентрации сахара или сразу в случае паточных меласс, которые сильно забуферены. В среду вносят 25–50% горячего остатка после отгонки растворителей. Это увеличивает выход растворителей, снижает количество добавляемых питательных веществ, сокращает затраты на нагревание и дает большую экономию пара, необходимого для выпаривания остатка. Ферментер и среду стерилизуют. Брожение протекает под избыточным давлением газов для создания анаэробных условий. Начальный рН 6,0, который снижается до ~ 5,4 через 24 ч.

Концентрация растворителей (при использовании крахмальной среды) через 50–56 ч ферментации 22,5 г/л, а соотношение ацетона, бутанола и этанола 30 : 60 : 10. Ферментация в мелассных средах завершается за 40–45 ч, а в крахмальных (с питательными добавками) – за 50–60 ч, в крахмальной без питательных добавок за 70–80 ч. Проточное выращивание бактерий ведется с работой серии из пяти ферментеров. За 18 дней получают продуктивность в 3 раза выше, чем при периодическом культивировании, но выходы растворителей низкие в связи с высоким образованием кислот в начальной фазе.

Выделение продуктов. Дистилляция – традиционный способ выделения этанола, ацетона, бутанола из разведенных водных растворов. При дистилляции продуктов ацетоно-бутилового брожения можно использовать тепло, выделяющиеся при охлаждении стерилизованного нагреванием ферментера. Дистилляция – достаточно гибкий процесс, при котором возможно фракционирование и выделение каждого продукта.

Более современными методом выделения продуктов являются мембранные процессы, например ультрафильтрация и обратный осмос. Выделение продуктов проводятся по принципу первапорации; это мембранный процесс, в котором движущей силой служит большой вакуум с одной стороны мембраны, свойства которой определяют эффективность разделения.

Хорошие результаты получают при селективной адсорбции растворителями на силикате (цеолите). Этот процесс можно интегрировать с ферментацией и работать с боле концентрированными растворами. Комбинирование ферментации и выделения продуктов возможно только при проточном культивировании. Возможно применение химического выделения. Это новый метод, основанный на обратимой химической реакции.

Хотя многие из перечисленных методов применяют в лабораториях и на пилотных установках, в большой промышленности они не внедрены в силу недостаточности данных или высокой стоимости. Наиболее реально внедрение в промышленность способа предварительного удаления воды (обратный осмос) с последующей традиционной дистилляцией (Воробьева, 1989).