Микроскопирование. При исследовании целлюлозоразрушающих бактерий извлекают пинцетом со дна пробирки кусочек разлагающейся бумаги и размазывают по предметному стеклу без добавления воды. Мазок сушат обычным способом, фиксируют на пламени горелки и окрашивают фуксином. В пробирках развиваются длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце – Clostridiumomelianskii, также наблюдается развитие длинных крупных палочек с грушевидной спорой на конце – Clostridiumdissolvens(Шильникова, 2004).

2.6 Выявление анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов, вызывающих маслянокислое брожение

Постановка опыта. Для обнаружения в почве анаэробных азотфиксирующих бактерий рода, которые также вызывают маслянокислое брожение, Clostridiumпользуются методом накопительной культуры в жидкой среде Виноградского (приложение). Среду наливают в пробирки высоким слоем, засевают комочками исследуемой почвы и пастеризуют 10 мин при 80° в целях освобождения от сопутствующих аэробных бесспоровых бактерий. Через 2–3 суток после посева среда мутнеет, из нее начинают выделятся пузырьки газа, что свидетельствует о развитии анаэробных споровых бактерий, вызывающих в соответствующих элективных условиях маслянокислое брожение. Глюкоза при этом превращается в масляную кислоту и углекислый газ, а в пробирках образуется много пены, появляется запах масляной и уксусной кислот. Последняя также является одним из продуктов маслянокислого брожения. Обычно этот метод используют для обнаружения клетокClostridiumpasteurianum, которые легко увидеть при микроскопировании осадка. Перед спорообразованием в клетках Clostridium pasteurianum накапливается много гранулезы, для которой характерно окрашивание раствором Люголя. Каплю жидкости, содержащую клетки клостридиев, накрывают покровным стеклом и к одному краю стекла подносят пипетку с раствором Люголя, а к другому – фильтровальную бумагу, которая засасывает раствор под покровное стекло. При микроскопировании препарата видны клетки клостридиев с потемневшим содержимым. Спора в клетке остается при этом неокрашенной и хорошо различима на темном фоне (Зенова, 2002).

3. Выделение бактерий рода Clostridium из разных объектов

3.1 Результаты посевов в жидкую среду Китт-Тароцци для выявления мезофильных и термофильных анаэробных микроорганизмов

Во всех пробирках (таблица 1, 2, 3) наблюдается помутнение среды, появление мути и гнилостного запаха, в некоторых пробирках – газообразование и образование пены на поверхности среды. Микроскопия показала наличие во всех пробирках спорообразующих грамположительных и грамотрицательных палочек. Тест на каталазу во всех пробирках отрицательный.

3.2 Результаты посевов для выявление возбудителей брожения пектиновых веществ

Во всех трех пробирках наблюдается помутнение среды, выделение газа, небольшое пенообразование. При микроскопировании обнаружены крупные палочковидные спорообразующие бактерии в виде барабанной палочки, окрашенные в синий цвет, с хорошо различимыми неокрашенными спорами, что свидетельствует о присутствии предположительно Clostridiumpectinovorumи Clostridiumfelsineum.

3.3 Результаты посевов в жидкую среду Омелянского для выявление возбудителей брожения целлюлозы

При осмотре накопительных культур со средой Омелянского через несколько суток в пробирках с разными пробами почвы получены следующие результаты.

Проба почвы №1 (ясеневый лес): появление неприятного гнилостного запаха, небольшое газообразование, помутнение среды, выпадение осадка белого цвета, появление на бумаге желтых пигментных пятен. При микроскопировании обнаружены длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце, что свидетельствует о присутствии предположительно Clostridiumomelianskii.

Проба почвы №2 (поле): появление неприятного гнилостного запаха, обильное газообразование, помутнение среды, пожелтение и разрушение бумаги в некоторых местах. При микроскопировании обнаружены длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце, что свидетельствует о присутствии предположительно Clostridiumomelianskii.

3.4 Результаты посевов на жидкую среду Виноградского

При осмотре накопительных культур со средой Виноградского через несколько суток в пробирках с разными пробами почвы получены следующие результаты.

Проба почвы №1 (ясеневый лес): четко видимые изменения, такие как помутнение среды, выделение пузырьков газа, образование пены, появление запаха уксусной кислоты. При микроскопировании капли жидкости накопительной культуры, окрашенной раствором Люголя, видны клетки с потемневшим содержимым и неокрашенными спорами, хорошо различимой на темном фоне. Это свидетельствует о присутствии в среде предположительно Clostridium pasteurianum.

Проба почвы №2 (поле): видимых изменений практически нет, за исключением небольшого, едва заметного, помутнения. Однако, при микроскопировании капли жидкости накопительной культуры, окрашенной раствором Люголя, обнаружены клетки с потемневшим содержимым и неокрашенными спорами, хорошо различимой на темном фоне, в небольшом количестве. Это свидетельствует о присутствии в среде предположительно Clostridium pasteurianum.

Таблица 1

Результаты посевов на среду Китт-Тароцци пробы №1 (килька в томатном соусе)

При сравнении морфологических и культуральных признаков с данными в определителе бактерий можно сказать, что данные микроорганизмы предположительно Cl. perfringens , Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans, Cl. termosaccharolyticum.

Таблица 2

Результаты посевов на среду Китт-Тароцци пробы №2 (кабачковая икра)