1 М NaCI 58,44 г.

Проавтоклавируйте.

7. 0,1 М ФМСФ Раствор используется для инактивации протеиназы К. Ресуспендируйте 17,5 мгФМСФ в1 мл изопропанола.

Помните, что раствор нестабилен, поэтому его надо использовать свежим и готовить перед употреблением. ФМСФ очень токсичен.

8. PSG

Этот раствор используется для отмывки простейших перед лизисом. Конечные концентрации На 1 л

75 мМ Na-фосфатный буфер 75 мл 1 М раствора

65 мМ NaCI 13 мл 3 М раствора

10% глюкоза 100 г.

Проавтоклавируйте.

Известно, что хромосомная ДНК из-за больших размеров молекулы чрезвычайно чувствительна к воздействию нуклеаз. В связи с этим необходимо принять за правило предварительно обрабатывать все растворы, контактирующие с ДНК. Растворы следует разлить на небольшие порции и простерилизовать. Стерильными должны быть и посуда, и оборудование. Для переноса образцов из вставок или из трубочек можно использовать изогнутую стеклянную палочку, простерилизованную в спирте и в пламени горелки. При работе с образцами ДНК нельзя пользоваться никакими приспособлениями, содержащими металлические детали, в частности из нержавеющей стали, а также шпателями и бритвенными лезвиями. ДНК прочно связывается со многими бивалентными металлами и контакт с ними обычно приводит к появлению разрывов в молекуле ДНК.

2. Приготовление вставок с образцами ДНК простейших

Свободно живущие простейшие могут быть прямо использованы для приготовления вставок с препаратами ДНК. Их можно отделить от культуральной среды центрифугированием. Перед приготовлением вставок внутриклеточных паразитов выделяют из клеток крови или других хозяйских клеток. Эритроциты можно лизировать, как указано в табл. 3. В некоторых случаях трипаносом выделяли из различных клеточных элементов с помощью ионно-обменной хроматографии на ДЕАЕ-носителе.

2.1 Выделение ДНК из культивируемых клеток и лимфоцитов

Процедуры получения ДНК из культивируемых клеток и из простейших имеют много общего. Для рестрикционного картирования необходимо использовать клеточные линии только с нормальным стабильным геномом. Например, клетки HeLa очень удобны для культивирования, но содержат большое количество хромосомных перестроек и имеют разную плоидность. Один миллион диплоидных клеток должен содержать примерно 6,6 мкг ДНК, что соответствует размерам генома 6х10 нуклеотидных пар. Поскольку несинхронизированные клеточные культуры обычно представляют собой смесь диплоидных, тетраплоидных и промежуточных состояний, мы используем для работы 1х10 клеток, считая, что они содержат примерно 10 мкг ДНК.

Процедуру, описанную в табл. 3, использовали также для получения интактных хромосом из различных клеточных линий насекомых. При этом концентрация клеток должна быть пересчитана в соответствии с меньшими размерами генома.

Методика выделения ДНК из лимфоцитов существенно близка используемой для культивируемых клеток, если лимфоциты свободны от примеси эритроцитов. Эритроциты могут быть или лизированы), или удалены с помощью центрифугирования в градиенте фиколла или перколла. Эти методы описаны в табл. 3.

2.2 Выделение ДНК из клеток прокариот

Методика выделения ДНК из клеток Е. coli представлена в табл. 4. Именно эта методика была с успехом использована для получения интактной хромосомной ДНК широкого набора бактерий и архебактерий, включая Salmonella, Legionella, Mycobacterium, Haemophilus, Bacillus, Streptomyces, Halobacterium и некоторые другие быстрорастущие, сопутствовавшие им. Размеры хромосом у этих бактерий варьируют в пределах от 1 до 20хЮ нуклеотидных пар, количество хромосом на одну клетку также может изменяться от 1 до 5 в зависимости от условий культивирования. Таким образом, в предварительные эксперименты необходимо включить подсчет клеток в широком диапазоне.

В некоторых случаях могут оказаться необходимыми небольшие изменения в методике. Например, в растворе Pett IV, когда его использовали для обработки Halobacterium, концентрацию NaCl пришлось увеличить до 0,5 М, чтобы предотвратить преждевременный лизис клеток.

Прием, описанный в табл. 4, предназначен для синхронизации репликативных вилок, которая достигается инкубацией клеток в хлорамфениколе в течение 1 ч непосредственно перед сбором. Обработка хлорамфениколом позволяет закончиться уже начатым репликативным процессам, но предотвращает запуск новых. Препараты ДНК можно получить и из несинхронизированных культур. Однако необходимо помнить, что области хромосом около точек конца репликации могут быть недопредставлены в некоторых препаратах. Иногда это не имеет значения, но не всегда. Так, например, интенсивность окрашивания бромидом этидия зависит от молекулярного веса. Таким образом, хромосомную ДНК из области терминации репликации будет непросто выявить с помощью этого соединения.

2.3 Выделение ДНК из клеток грибов

Мы предлагаем две методики для дрожжей. Первая из них предназначена для Saccharomyces cerevisiae, а вторая – для делящихся клеток Schlzosaccharomyces pombe. В обоих случаях для удаления клеточной стенки и приготовления сферопластов используется зимолиаза 100 Т. Получить сферо-пласты из 5. pombe более трудно. В этом случае мы рекомендуем контролировать процесс лизирования под микроскопом.

Другие представители грибов могут иметь иные, нежели дрожжи, компоненты клеточной стенки. В этом случае полезно вспомнить, что существуют разнообразные зимолиазы, отличающиеся друг от друга по своей специфичности и активности. В каждом конкретном случае можно подобрать подходящий фермент. К сожалению, в этих ферментах присутствует большое количество примесных нуклеаз, которые препятствуют получению больших фрагментов ДНК. Препарат «Новозин», выпускаемый фирмой Novo Bio Labs, является смесью ферментов, воздействующих на клеточную стенку самых разных грибов. Мы так и не решились использовать этот препарат; нас смутил его коричневый цвет. Вероятно, необходима более тщательная очистка.

2.4 Выделение ДНК из растительных клеток

Усилия многих исследователей направлены'сейчас на разработку методов получения интактных хромосомных ДНК из солидных тканей. Предварительные эксперименты с плоскими червями, Caenorhabditis elegans, личинками Drosophila и с Chlamy-domotias продемонстрировали возможность использования различных приемов. Для небольших многоклеточных организмов могут пригодиться методы, применяемые для одноклеточных. Для предотвращения выхода подвижных клеток за пределы вставок полезна обработка раствором 0,2 мМ азида натрия. ДНК с большим молекулярным весом удается получить при обработке коллагеназами, гомогенизировании, трипсинизации или просто разрезании материала, помещенного в раствор ESP. Можно вначале выделить из клеток ядра, а затем из них приготовить вставки с образцами.