Введение

Метод пульс-электрофореза дает возможность разделять ДНК индивидуальных хромосом дрожжей и простейших. Размеры этих молекул варьируют от 0,2 до 10x106 нуклеотидных пар. В настоящее время создана технология выделения и обработки ДНК таких больших размеров как для эукариот, так и для прокариот. Таким образом, теперь существует возможность изучать целые хромосомы, последовательности ДНК которых насчитывают несколько миллионов оснований. Получены физические карты больших районов некоторых хромосом млекопитающих и целой хромосомы Esherichia coli. Цель этой работы – рассказать о биохимических методах, используемых при выделении больших молекул ДНК, и методах ПЭФ, применяемых для их анализа.

1. Приготовление образцов ДНК

Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, используя традиционные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. В основе их – огромное осевое отношение молекул ДНК. Например, человеческая хромосома 21-самая маленькая в геноме. Ее ДНК насчитывает 50х10 п. н.и представляет собой единственную молекулу длиной 15 мм. Между тем диаметр этой молекулы всего 20 нм. Таким образом, осевое отношение составляет 10.

Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток проводят в присутствии агарозы. Этот прием достаточно прост, и получаемые таким способом образцы можно затем использовать в традиционных электрофоретических опытах и экспериментах по клонированию. Живые клетки суспендируют в расплавленной низкоплавкой агарозе. Затем агарозе дают застыть в формочках объемом 100 мкл для формирования блоков, называемых вставками. Формочки можно приобрести у фирмы Pharma-cia-LKB или сделать самим, соединив вместе «хвост к голове» обычные гребенки для электрофореза нужных размеров. Все манипуляции с формочками следует проводить так, чтобы предотвратить их загрязнение нуклеазами. Перед употреблением формочки необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и вытереть, одев перчатки. Затем одна сторона формочки заклеивается лентой, используемой в качестве донышка.

В качестве альтернативы агарозным блоквставкам могут выступить агарозные гранулы. Для их получения клеточную суспензию в агарозе по каплям добавляют в масло с одновременным перемешиванием. Размеры гранул контролируются скоростью перемешивания. С образцами ДНК в гранулах можно обращаться так же, как с растворенными. Однако мы предпочитаем использовать агарозные вставки, так как с ними проще работать.

Для выделения ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки, поместите заполимеризовавшиеся агарозные вставки в раствор ESP и инкубируйте 2 дня при 50°С. В этом растворе происходит лизис клеток и отделение белков и других молекул от ДНК. Интактную хромосомную ДНК можно анализировать с помощью ПЭФ непосредственно из раствора ESP. Образцы ДНК в растворе ESP хранятся неопределенно долго при +4°С или даже при комнатной температуре прямо в пробирках Эппендорф.

При наличии клеточной стенки ее необходимо удалить перед экстракцией ДНК, поместив клетки в раствор ESP. Методики выделения ДНК из клеток с интактной стенкой представлены в табл. 4–6. Состав клеточной стенки значительно варьирует для различных организмов. В некоторых случаях может оказаться необходимым подбор различных ферментов, расщепляющих полисахариды клеточной стенки. Многие из этих ферментов не требуют для своей работы присутствия двухвалентных катионов. Таким образом, обработка этими ферментами может проводиться в присутствии большого количества ЭДТА для предотвращения деградации хромосомной ДНК-

Все образцы должны быть обязательно проинкубированы в растворе ESP в течение 2 дней при 50°С. Вставки станут прозрачными гораздо раньше окончания инкубации. Однако инкубацию следует продолжить, чтобы добиться полного отделения от ДНК связанных с ней различных молекул. Белки, связанные с ДНК, могут изменять ее электрофоретическую подвижность. Кроме того, образцы, проинкубированные более короткое время, оказываются устойчивыми к воздействию некоторых рестриктаз.

Наиболее общая проблема, возникающая при использовании описанной ниже техники получения ДНК из новых организмов, – это измерение конечной концентрации ДНК. Надо стремиться к тому, чтобы концентрация ДНК в агарозной блоквставке была «удобна» для нанесения на форезный гель. Такая концентрация должна быть определена эмпирически. Возможное число клеток и количество ДНК предложены в прилагаемых протоколах опытов. Эти цифры можно использовать как предварительные и менять в зависимости от условий куль-

1. 50 хисходный раствор Денхардта

Этот раствор – одни из компонентов смеси для прегибрндизации и гибридизации

На 500 мл раствора:

поливинилпирролидои 5 г, фиколл 5 г, БСА, фракция V 5 г.

Простерилизуйте фильтрацией через одноразовый фильтр и храните в аликвотах по 30 мл при – 20°С.

2. Раствор для лизиса клеток Е. coli

Раствор можно использовать для приготовления сферопластов из различных бактерий

Конечные концентрации На 1 л

6 мМ трис-HCl 6 мл 1 М раствора

1 М NaCl 58,4 г

100 мМ ЭДТА 100 мл 0,5 М раствора

0,5% бридж-58 60 мл 10%-ного раствора

0,2% дезоксихолата 50 мл 4%-ного раствора

0,5% са|ркозила 5 мл 100%-ного раствора

Проавтоклавируйте

Добавьте свежими: 1 мг/мл лизоцима яичного белка 20 мкл/мл бычьей панкреатической РНКазы

3. ESP

Этот раствор используется для выделения любых больших молекул ДНК.

Он имеет еще одно название – NDS.

Конечные концентрации

0,5 М ЭДТА

Автоклавируйте

1% лаурилсаркозин

Тщательно перемешайте до полного растворения 1 мг/мл протеиназы К Инкубируйте 2 ч при 37°С Храните в аликвотах замороженным

Для работы: смешайте с равным объемом образца и инкубируйте 1–2 дня при 50°С.

4. Смесь для прегибрндизации и гибридизации Конечные концентрации На 1 л

3хSSC 100 мл 30 X раствора

0,1% SDS 5 мл 20%-иого раствора

10Х раствор Денхардта 200 мл 50х раствора

10% декстрансульфат> 200 мл 50%-го раствора

ДНК спермы лосося 5 мг/мл

Смесь храните замороженной в аликвотах по 30 мл для прегибридизационного раствора и в аликвотах по 20 мл для гибридизационного раствора.

5. 1ХМ9

На 1 л: 50 г. Na2HPO «

30 г. КН2Р04

5 г NaCl

10 г. NH4C1

Разведите до однократной концентрации и проавтоклавируйте.

После автоклавирования добавьте Конечные концентрации На 1 л

1 мМ MgS04 1 мл 1 М раствора

0,1 М СаС12 0,2 мл 0,5 М раствора

0,4% глюкоза 10 мл 40%-ного раствора

0,5% казаминокислот 25 мл 20%-ного раствора

Необязательные добавки

50 мкл/мл аминокислот 10 мл раствора 5 мг/мл

10 мкг/мл витаминов 10 мл раствора 1 мг/мл

50 мкг/мл оснований 25 мл раствора 2 мг/мл

6. Pett IV

Этот раствор предназначен для отмывки бактериальных клеток перед выделением сферопластов

Конечные концентрации На 1 л

10 мМ трис-HCl 10 мл 1 М раствора