в. Трансмембранные элементы; неполярная часть поверхности контактирует с липидами, а полярные группы – с полярными группами других трансмембранных элементов. Именно этот принцип лежит в основе «вывернутых» структур, каким предположительно является бактериородопсин. Полярные взаимодействия между амфифильными спиралями в принципе могли бы стабилизировать взаимодействия между субъединицами в олигомерных белках.

3. Третичные амфифильные структуры. Об их существовании можно говорить только предположительно. Их гидрофобная поверхность должна формироваться на уровне третичной структуры остатков, расположенных в самых разных участках полипептидной цепи. Подобные структуры могут быть характерны для белков, связывающихся с бислоем, но не имеющих четко выраженных гидрофобных доменов, определяемых по любому из указанных выше критериев. Возможным примером такого рода является а-лактальбумин.

Ионизируемые аминокислотные остатки в трансмембранных сегментах

Многие модели мембранных белков предполагают, что в их трансмембранных сегментах находятся ионизируемые остатки. Эти остатки, вероятно, играют важную функциональную и / или структурную роль. В некоторых случаях эта роль однозначно установлена: 1) остатки лизина в бактериородопсине и родопсине образуют шиффовы основания с простетической группой ретиналя, что необходимо для светового возбуждения молекулы; 2) остатки гистидина в полипептидах реакционного центра бактерий участвуют в связывании с фотосинтетическими пигментами; 3) заряженные остатки в лактозопермеазе из Е. coli участвуют в осуществлении этим белком транспортных функций; возможно, эти остатки образуют сеть водородных связей внутри молекулы белка.

Перенос заряженных групп из воды в среду с низкой диэлектрической проницаемостью внутри мембраны энергетически очень невыгоден, и эти группы необходимо каким-либо образом стабилизировать. Неоднократно предполагалось, что для стабилизации достаточно образования ионных пар, и этот принцип использовался при построении трехмерной модели бактериородопсина. Однако расчеты показали, что свободная энергия переноса ионной пары из воды в среду с низкой диэлектрической проницаемостью тоже весьма велика. Для дальнейшей стабилизации необходимы дополнительные полярные взаимодействия, возможно, с участием других полярных групп или с помощью водородных связей.

В принципе даже одиночная заряженная группа внутри мембраны может стабилизироваться через взаимодействия с полярными группами и при участии водородных связей, эффективно делокализующих заряд. Можно привести несколько примеров изолированных, де-сольватированных ионов, стабилизированных за счет взанмодействий в водорастворимых белках. Аналогичные принципы, по-видимому, действуют в случае заряженных остатков трансмембранных сегментов интегральных белков.

Однако представляется более вероятным, что ионизируемые аминокислоты нейтрализуются внутри мембраны за счет протонирования или депротонирования. Свободная энергия нейтрализации заряженных аминокислот, по оценкам, составляет примерно 10–17 ккал / моль. В отсутствие специфических условий для полярных взаимодействий, стабилизирующих заряженный остаток в трансмембранном сегменте, он скорее всего будет нейтрализован.

Заряженные аминокислоты в сегментах, экспонированных в водную среду

Как мы уже говорили, заряженные остатки распределены между двумя сторонами реакционного центра бактерий асимметрично. Такая асимметрия характерна и для некоторых других внутренних мембранных белков бактерий. Так, основные остатки Lys и Arg в четыре раза чаще встречаются в тех соединяющих трансмембранные элементы участках, которые расположены на внутренней стороне мембраны, а не на наружной. Для кислых остатков Asp и Glu подобная тенденция не выявляется. Возможно, эта асимметрия связана с механизмом сборки мембранного белка, но как именно – неясно. Более того, неизвестно, можно ли обобщить это наблюдение и имеет ли оно какую-либо предсказательную ценность.

В глобулярных, водорастворимых белках остатки пролина редко находятся в серединной части а-спирали. По данным исследований 58 белков, содержащих 331 а-спираль, выявлено 30 таких случаев. В половине из них пролин располагался в местах повреждения спирали, а в остальных случаях находился в области искривления или нерегулярности структуры.

В то же время у бактериородопсина пролиновые остатки расположены в средней части трех из семи трансмембранных спиралей, а у родопсина – в пяти из семи таких спиралей. Подобная тенденция выявлена и для других трансмембранных сегментов интегральных белков, особенно транспортных. Значение этого феномена неизвестно. Следует отметить, однако, что из-за наличия циклической боковой цепи пролин не образует водородных связей с остатками, находящимися на предыдущем витке а-спирали. Это может способствовать формированию структур, в которых водородная связь образуется за счет специфичного взаимодействия с остатком, расположенным в другом пронизывающем мембрану участке. Подобное полярное взаимодействие внутри бислоя могло бы стабилизировать трехмерную структуру мембранных белков.

Способы идентификации первичных амфифильных структур

Однозначная структурная информация о мембранных белках получена лишь в нескольких случаях, но зато в распоряжении исследователей имеются обширные данные об аминокислотной последовательности, основанные на результатах секвенирования ДНК. Для идентификации трансмембранных а-спиралей, предположительно имеющих длину – 20 остатков и состоящих преимущественно из гидрофобных аминокислот, разработано несколько методов анализа аминокислотной последовательности. В основе каждого из них лежит расположение аминокислот в ряд в соответствии с неким параметром, который отражает вероятность обнаружения этого остатка в трансмембранном сегменте.

Существует два типа шкал. В одном случае аминокислоты классифицируют по их относительной полярности или «гидрофобности». Эти шкалы имеют термодинамическую природу и основаны на величине изменения свободной энергии при переносе аминокислоты из водного раствора в углеводородную среду. Однако число способов количественной оценки гидрофобности аминокислот весьма велико, и они не во всем согласуются между собой. Часто используются данные, относящиеся одновременно к более чем одной физической характеристике. Примером такого рода является шкала «гидропатии» Кайта и Дулиттла, основанная на данных о гидрофобности, измеряемой по потенциалу гидрации, а также о вероятности нахождения остатков внутри глобулы.

Шкала Голдмана, Энгелмана и Стейца основана на количественной оценке свободной энергии переноса а-спиралей из водной среды внутрь мембраны. На рис. сравнивается шкала Кайта – Дулиттла со шкалой Голдмана–Энгелмана–Стейца.

По оценка Энгелмана и др., изменение свободной энергии при внедрении в мембрану полианионной а-спирали длиной 20 остатков составляет 30 ккал / моль. Расчет основан на оценке площади поверхности спирали, экспонированной в растворитель. Вклад в энергию каждой боковой группы оценивали с учетом площади поверхности, экспонированной в водную среду внутри спирали. Учитывали также свободную энергию переноса в бислой полярных групп. Например, предполагали, что глутамин при переносе в бислой будет протонироваться и свободная энергия этого процесса составит 10,8 ккал / моль. Подобно этому, перенос гидроксилов будет «стоить» примерно 4,0 ккал / моль.