Фрагмент схемы апоптоза, протекающего под контролем белков семейства Bcl-2, а также с участием p53.

Объяснения в тексте.

В запуске апоптоза, вызванного повреждениями ДНК, активацией онкогенов и гипоксией, принимает участие белок-53 (р53), взаимодействуя с Вах, стимулируя “рецепторы смерти” и апоптозные гены. р53 активирует модулятор суицида PUMA (p53 upregulated modulator of APOptosis), который затем связывает Bcl-2 и выводит из строя этот препятствующий апоптозу белок. Тем самым выход цитохрома с из митохондрий уже ничем не сдерживается.

Некоторые белки, связывающие ионы кальция, например ALG-2, кодируемый одноименным геном (APOptosis-linked gene-2), тоже принимают участие в запрограммированной смерти. Так, взаимодействием ALG-2 и белка Alix (ALG-interacting protein X, известный и как AIP1) осуществляется регуляция апоптоза. Часть сложной молекулы ALG-2 представляет собой еще один апоптозный белок кальпоин.

Кальпоины специфически расщепляют белки, содержащие области, называемые PAST-мотивами и богатые остатками четырех аминокислот - пролина (P), аспарагиновой кислоты (A), серина (S) и треонина (T). (Среди этих белков - фермент ДНК-лигаза, у которого такой мотив находится в N-концевой области.) Кроме того, кальпоины освобождают каспазы от связанных с ними ингибиторов апоптозных белков (inhibitors of APOptosis proteins, IAPs).

Впервые обнаруженные у вирусов, гомологи IAP позже были найдены у всех эукариот, от дрожжей до млекопитающих. У последних открыто восемь представителей этого семейства ингибиторов, и каждый имеет от одного до трех 70-аминокислотных участков, называемых BIR-доменами (baculoviruses inhibitor of APOptosis repeat domains - повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза). Кодируемый Х-хромосомой IAP (XIAP) и клеточные ингибиторы апоптозных белков (cellular inhibitors of APOptosis protein; cIAP1, 2) содержат по три N-концевых BIR-домена и С-концевой RING-домен, кодируемый геном ring (really interesting new gene - действительно интересный новый ген). Эти белки ингибируют каспазы-3, -7, -9: BIR-домены целенаправленно связываются с ними, блокируя их активные центры; RING-домен обеспечивает деградацию каспаз, пришивая к ним “черную метку” - 76-аминокислотный белок убиквитин. Присоединившие его белки подвергаются расщеплению протеасомой *.

* Об этом специфическом пути деградации белков см.: Абрамова Е.Б., Карпов В.Л. Протеасома: разрушение во имя созидания // Природа. 2003. №7. С.36-45.

Есть и другой эндогенный ингибитор каспаз - FLIP (FLICE-inhibitory protein). Он взаимодействует с пособниками суицида - сигнальными комплексами, блокируя активацию прокаспазы-8 и передачу проапоптического сигнала от “рецепторов смерти”.

Как все ингибиторы протеаз, XIAP, cIAP1 и cIAP2 сами подвержены отрицательной регуляции. В частности, митохондриальный полипептид Smac/DIABLO (direct IAP-binding protein with low pI - белок с низкой pI, прямо связывающий IAP), выходя из митохондрий в цитозоль, связывается с ингибиторами XIAP, cIAP1 и cIAP2 и мешает им взаимодействовать с каспазами. Но XIAP, cIAP1 и 2 способны противостоять ингибирующему действию Smac/DIABLO, присоединяя к нему убиквитин - сигнал для деградации. Одна из изоформ Smac/DIABLO, Smac3, сама стимулирует присоединение убиквитина к XIAP. В высоких концентрациях каспазы-3 и -7 могут расщеплять XIAP и без посредников.

Как видим, клетка никогда не бросается в апоптоз без “раздумий”. Она сначала задает себе гамлетовский вопрос: “Быть или не быть?”. Ответ на него зависит от соотношения про- и антиапоптозных белков; между ними идет борьба, и побеждает та сторона, которая успевает навесить на другую “черную метку” - убиквитин. А протеазам совершенно все равно, на ком эта метка - они беспристрастно расщепляют меченые белки. Таким образом, выбор клетки между жизнью и смертью зависит не столько от внешних обстоятельств, сколько от ее собственного внутреннего состояния. Даже если организм приказывает клетке погибнуть, она подчиняется ему только в том случае, когда сама расположена к такому исходу. Бывают мутанты, которые категорически не хотят умирать, при том что все внешние обстоятельства побуждают их к суициду - как правило, это раковые клетки.

Общая схема “классического” апоптоза млекопитающих.

Мы перечислили все виды орудий самоубийства, которыми клетка многоклеточного организма пользуется, когда он приказывает и когда она сама того хочет. Но следует понимать, что их действие неоднозначно. Например, кальций и активные формы кислорода участвуют во всех без исключения процессах жизнедеятельности как вторичные посредники в передаче сигналов и регулируют все функции клетки: размножение, дыхание, обмен веществ, движение, рост. Тот же кальций способен, в частности, активировать антиоксидантные ферменты, защищающие клетку от окислительного стресса. АФК в микромолярных концентрациях необходимы для пролиферации клеток, их подвижности и хеморецепции; более того, некоторые виды (например, NO) даже блокируют апоптоз посредством избирательного нитрозилирования эффекторных каспаз. Да и каспазы тоже могут выполнять вполне “мирные” функции - управлять дифференцировкой некоторых типов клеток.

Таким образом, лишь немногие из орудий самоубийства служат только этой цели: большинством из них клетка пользуется и в “домашнем быту”. Возникает вопрос: а все ли они необходимы для совершения суицида? И если нет, то зачем производить столь непомерный арсенал орудий? На эти вопросы мы сможем ответить, когда рассмотрим специфику протекания запрограммированной смерти у одноклеточных организмов.

Суицид у одноклеточных

Практически у всех простейших организмов внешние признаки апоптоза те же самые, что у клеток многоклеточных, и, как у них, к гибели приводят разные причины. У одноклеточных водорослей ее вызывает отсутствие света или окислительный стресс, а предотвращают ингибиторы каспаз и антиоксидантный фермент, расщепляющий Н2О2, - каталаза (каспазы у них тоже выявлены - с помощью антител). Паразитические жгутиконосцы кончают жизнь самоубийством, если им помогают ингибитор протеинкиназы С ставроспорин (он же стимулирует апоптоз и в клетках млекопитающих) и перекись водорода, а предотвращают тоже ингибиторы каспаз. Экстракт цитоплазмы паразитического простейшего Leishmania major в опытах вызывал характерные для апоптоза изменения в изолированных ядрах млекопитающих, свидетельствуя о присутствии в нем AIF-подобных белков. Изолированные митохондрии L.major теряли цитохром c при инкубации с рекомбинантным Вах человека даже тогда, когда Вах был лишен трансмембранного домена, необходимого для встраивания в наружные мембраны митохондрий. Следовательно, у L.major есть белки, способные взаимодействовать с Вах.

У дрожжей найдены практически все орудия суицида, имеющиеся у многоклеточных, кроме лизосомальных катепсинов и представителей семейства Bcl-2. Тем не менее, гены проапоптозных белков млекопитающих при экспрессии в дрожжах вызывают их запрограммированную гибель, а Bcl-2 защищает пекарские дрожжи (Saccharomyces сerevisiae) от гибели, вызванной окислительным стрессом. У Shizosaccharomyces pombe найден Rad9-белок, содержащий последовательность аминокислот, необходимую для взаимодействия с Bcl-2.