Как пример охарактеризован белок Каизо. Каизо, с одной стороны, связывается с катенином р120, а с другой - способен подавлять транскрипционную активность метилированных генов. Каизо имеет доменную структуру и состоит из N-концевого BTB/POZ домена и C-концевых цинковых пальцев типа C2H2. Цинковые пальцы специфично связывают 5-метил цитозин содержащую ДНК.

Нокаут гена Каизо приводит к частичной резистентности животных к раку кишечника. Кривая выживаемости животных с нокаутом гена Каизо (красная линия) в модели спонтанного рака кишечника APC(Min). Черной линией показана кривая выживаемости контрольных животных

Проведен генетический нокаут гена Каизо у мышей. Показано, что животные без Каизо (Каизо-КО) развиваются нормально и не имеют выраженных патологий . При переведении Каизо-КО животных на генетический фон с высоким процентом спонтанных опухолей кишечника происходит увеличение срока жизни животных, уменьшается средний размер полипов в кишечнике. Таким образом, установлено, что без Каизо происходит замедление роста опухолей кишечника в APC(Min) моделях Напротив, при выключении гена Каизо в зиготах лягушки происходит апоптотическая смерть клеток эмбрионов на стадии нейрулы. В отличие от мыши, ген Каизо является необходимым для жизнедеятельности земноводных. Эти данные были подтверждены и на рыбах Danio Rerio . Получены линии клеток с множественными генетическими нокаутами генов MBD2, MeCP2 и Каизо. Показано, что белки MBD2, MeCP2 и Каизо оказывают синергетическое действие (репрессируют) метилированный промотор гена Xist . Показано, что мутации в гене Каизо не являются ключевыми в инициировании синдрома Ретта (нейродегенративное заболевание у девочек) , хотя другой метил ДНК связывающий белок MeCP2 напрямую вовлечен в эту патологию.

В геноме позвоночных найдены и охарактеризованы два гена, кодирующих белки ZBTB4 и ZBTB38, которые по своей аминокислотной последовательности и расположению консервативных доменов являются родственниками Каизо. Показано, что эти два белка являются метил ДНК зависимыми транскрипционными репрессорами.

Каизо подобный белок ZBTB4 расположен в метилированных участках гетерохроматина. Клетки без метилирования - мышиные эмбриональные фибробласты с генетической делецией генов dnmt1-/- и p53-/-. Клетки с нормальным уровнем метилирования - мышиные эмбриональные фибробласты p53-/-. В случае dnmt1-/- p53-/- клеток видно отсутствие корреляции между локализацией ZBTB4 в гетерохроматине (DAPI), в то время, как в p53-/- клетках видна полная ко-локализация ZBTB4 и гетерохроматина.

3. "Программируемый нокаут генов"

Следует отметить, что не все гены можно инактивировать на стадии зародыша. И, естественно, нельзя получить клетки или животных, нокаутированных по так называемым генам домашнего хозяйства. Однако для генов, принимающих участие в эмбриональном развитии, разработан подход, позволяющий проводить их инактивацию после развития организма. Данная стратегия позволяет "выключать" гены в определенных условиях ("программируемый нокаут генов", англ. conditional knockout), а именно в необходимой исследователю ткани или группе клеток и/или под воздействием индуцирующего вещества.

Это можно осуществить с помощью методики, сочетающей гомологичную рекомбинацию, как в случае классического нокаута генов, и системы сайт-специфической рекомбинации. Сайт-специфические рекомбиназы – это ферменты, узнающие особые участки ДНК и совершающие обмен между ними. Наиболее часто используются Cre рекомбиназа бактериофага P1 и Flp рекомбиназа (флипаза) дрожжей. Эти ферменты распознают нуклеотидные последовательности в 34 основания, называемые, соответственно, loxP и frt сайты [16]. Если эти последовательности расположены в одной ориентации, рекомбинация по ним приведет к делеции фланкированного участка. Если же ориентация последовательностей различна, то это приведет к инверсии фрагмента между ними (рис. 5).

Рис. 5. Схема механизма сайт-специфической рекомбинации. В зависимости от ориентации loxP-сайтов происходит либо делеция, либо инверсия фланкированого фрагмента [20].

Использование стратегии "программируемого нокаута гена" требует создания двух линий мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем ткане-специфичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта, фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена (экзон, промотор и т.д.) [25]. Следует отметить, что вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов, но не должны затрагивать функциональные последовательности (рис. 6).

Рис. 6. Схема использования тканеспецифичной Cre-loxP рекомбинации для получения мышей с программируемым нокаутом гена [25].

Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток, где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre [25]. Используя стратегию "программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при использовании стандартной процедуры нокаута генов.

4. Линии нок-аутных мышей

4.1 ФНО/ЛТ панель

Окраска шерсти: черные.

Происхождение: линии выведены в лаборатории молекулярной иммунологии ИМБ им. В. А. Энгельгардта РАН методом генетического нокаута и переведены на генетическую основу C57BL/6 путем возвратного скрещивания. Панель содержит линии мышей с модифицированным геном фактора некроза опухолей (ФНО) и лимфотоксина (ЛТ), подготовленные к тканеспецифической делеции гена, а также линии мышей с делецией гена ФНО или ЛТ специфично в макрофагах/нейтрофилах, либо в Т- или В-лимфоцитах, либо в клетках зародышевой линии.

Характеристика линии:

у мышей с полной делецией гена ФНО нарушена защита от ряда патогенов;

у мышей с полной делецией гена ЛТ-бета нарушена структура вторичных лимфоидных органов и антиген-специфическая продукция некоторых классов иммуноглобулинов.

Основные области использования: данные мыши представляют собой уникальную панель для изучения роли тканеспецифической продукции цитокинов семейства ФНО при врожденном и приобретенной иммунодефиците.

Ключевые публикации:

Tumanov et al. Distinct role of surface lymphotoxin expressed by B cells in the organization of secondary lymphoid tissues. Immunity. 2002 Sep;17(3):239-50.

Grivennikov et al. Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity. 2005 Jan;22(1):93-104.

4.2 BALB/cMBD2

Окраска шерсти: белые.

Происхождение линии: линия получена в Эдинбургском Университете (Великобритания) в лаборатории Эдриана Бёрда (Adrian Bird) путем генетического нокаута гена MBD2 в мышах линии BALB/c