Одна молекула ДНК на клетку. При планировании эксперимента по молекулярному клонированию и его проведении необходимо соблюдать два основных принципа. Во-первых, после конструирования in vitro отдельные молекулы рекомбинантных ДНК должны быть введены в разные структуры. Ни одна из клеток не должна получить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы. Во-вторых, эти структуры должны быть способны к репликации.

В результате трансфекции и инфекции образуются популяции самых разных клеток либо популяции вирусов или бактериофагов. Одни члены популяции содержат нужные рекомбинантные молекулы, другие несут рекомбинанты, содержащие нежелательные вставки, или векторные молекулы вообще без вставки, третьи представляют собой неизмененные клетки. Кроме того, могут встречаться разнообразные непредсказуемые и аберрантные рекомбинанты, в том числе векторы, в которые включены две или более вставок, и рекомбинанты, у которых в результате рекомбинации уже в клетке-хозяине произошло изменение вставки. Таким образом, трансфекция и инфекция не являются последним этапом эксперимента по получению рекомбинантной ДНК, а представляют лишь один из его этапов. Далее нужно провести клонирование и идентификацию нужного рекомбинанта.

б. Клонирование

Необходимым условием успешного клонирования является возможность разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток. Только в этом случае каждый клон будет представлен отдельной колонией бактериальной или животной клетки или негативной фаговой либо вирусной колонией и будет содержать определенную рекомбинантную ДНК.

Плазмидные векторы. Трансфицированные клетки высевают на агар таким образом, чтобы они были полностью изолированы одна от другой и каждая могла дать начало отдельной колонии. Обычно векторы содержат по крайней мере один селективный маркер, по которому проводится отбор трансфицированных клеток. При этом нетрансфицированные клетки не могут образовывать колонии в используемой среде.

Фаговые векторы. Инфицированные клетки высевают на газоне чувствительных клеток, на котором в результате инфицирования соседних клеток образуются фаговые бляшки. Некоторые векторные системы имеют встроенные маркеры, позволяющие легко отбирать рекомбинанты среди реконструированных интактных векторов.

Векторы, сконструированные на основе вирусов животных. Трансдуцирующие 8У40-векторы, способные продуцировать вирусные частицы, клонируются так же, как и фаговые векторы. Однако, поскольку такие 8У40-векторы нуждаются в вирусе-помощнике, восполняющем утраченные ими функции, вирусные бляшки могут содержать как рекомбинантные геномы, так и геномы помощника. Плазмида, сконструированная на основе вируса SV40, и пассивно трансформирующие векторы, которые не продуцируют вирусных частиц, сначала клонируют как челночные векторы в клетках Е. coli. Обычно они содержат селективный маркер, определяющий фенотип животной клетки, что позволяет отобрать клоны трансформированных клеток. Аналогично рекомбинантные векторы на основе папилломавирусов крупного рогатого скота и ретровирусов клонируют в клетках Е. coli как челночные векторы, а затем трансфицируют ими клетки животных.

Скрининг клонированных популяций рекомбинантных молекул

а. Обнаружение нужного клона

После разделения рекомбинантных молекул и получения отдельных клонов встает трудно разрешимая задача-обнаружение нужного клона или клонов. Идентификация клона основывается на том, что вставка в рекомбинантной ДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей ее клетки. Это свойство может определяться структурой самой вставки либо быть связанным с ее функцией. На нем основывается скрининг популяции клонов с целью идентификации одного нужного клона. Методы скрининга должны быть очень чувствительными, поскольку иногда приходится идентифицировать один клон из сотен тысяч или даже миллионов клонов.

б. Отжиг с комплементарным полинуклеотидом

Комплементарные одноцепочечные полинуклеотиды, будь то РНК или ДНК, при соответствующих условиях с легкостью ренатурируют, несмотря на присутствие большого избытка неродственных цепей. Благодаря этому исследователь получает мощный инструмент для обнаружения специфической вставки, который можно использовать в разных ситуациях.

Отжиг с радиоактивным зондом. Предположим, что мы имеем большую популяцию клонированных рекомбинантных молекул и проводим отжиг с определенным полинуклеотидным зондом. Тогда мечеными становятся только те рекомбинантные молекулы, которые содержат последовательности, комплементарные зонду. Успех эксперимента зависит прежде всего от наличия нужного зонда.

Для скрининга большого числа колоний, содержащих плазмиды, а также фаговых бляшек разработаны удобные и быстрые методы. На тех же принципах основан и скрининг 8У40-бляшек. Метод состоит в том, что бактериальные колонии или бляшки переносят с агара на иммобилизованную подложку, например на нитроцеллюлозный фильтр, и подвергают содержащуюся в них ДНК денатурации. Затем фильтр инкубируют в растворе, содержащем денатурированный 32Р-ме-ченный зонд, в условиях, способствующих ренатурации комплементарных цепей. Если колония или бляшка содержит ДНК, комплементарную зонду, то на радиоавтограмме в соответствующем месте будет наблюдаться потемнение. Несмотря на то что каждая бляшка или колония содержит лишь небольшое количество ДНК, ее удается выявить благодаря высокой удельной радиоактивности зондов.

Получить большие коллекции клонированных колоний или бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах не составляет труда. Бактерии и дрожжи хорошо растут на самом нитроцеллюлозном фильтре, помещенном на соответствующий питательный агар. Фильтр, содержащий колонии, обрабатывают так, чтобы произошли лизис клеток и денатурация ДНК, отжигают денатурированную ДНК с зондом, идентифицируют бляшки, ДНК которых гибридизовалась, и отбирают клетки из соответствующего участка агара. Фаговые бляшки переносят на нитроцеллюлозный фильтр, наложив его на питательный агар. За один раз на фильтр может быть перенесено до 10000 бляшек с одной чашки диаметром 10 см. Если осторожно снять фильтр, то ДНК из каждой бляшки останется фиксированной на нем. После отжига и идентификации нужных бляшек можно отобрать фаговые частицы из бляшек, оставшихся на чашке с агаром.

Аналогичным образом можно выявить упакованные рекомбинантные молекулы вируса SV40. Питательный агар, покрывающий инфицированный монослой клеток обезьяны, удаляют, весь монослой переносят на нитроцеллюлозный фильтр и идентифицируют нужные бляшки путем отжига с соответствующим радиоактивно меченным зондом. Вирионы, содержащие рекомбинантные ДНК, отбирают из агарового слоя.

В качестве зондов можно использовать высоко очищенные мРНК и денатурированные гомологичные ДНК или кДНК. Особенно удобны одноцепочечные зонды, поскольку их не нужно денатурировать и тестируемые клонированные ДНК не конкурируют с другими гибридизующимися цепями ДНК во время отжига. мРНК-зонды уже являются одноцепочечными, а одноцепочечные кДНК-зонды легко получить, скопировав только одну цепь. Одноцепочечные РНК-зонды можно также приготовить из рекомбинантной плазмиды, содержащей последовательность зонда, встроенную в специальный вектор, например pGEM. Этот вектор содержит два разных высокоспецифичных бактериальных промотора, фланкирующих вставку в рекомбинантных молекулах. Используя очищенную соответствующим образом линеаризованную плазмиду в качестве матрицы in vitro и ту или иную из РНК-полимераз прокариот, синтезируют РНК, которая представляет собой копию одной из двух цепей вставки.