Рассмотрим процесс получения клонированных ДНК. На первом этапе готовят фрагменты ДНК, пригодные для последующего лигирования с векторной молекулой. Следующий этап состоит в самом лигировании. Эти процессы осуществляются in vitro. Далее рекомбинантные молекулы вводят в клетки, где они амплифицируются путем репликации. Затем проводят клонирование, отбор и дальнейшую амплификацию.

Вставки

а. Общие положения

При конструировании рекомбинантных молекул обычно используют сложные смеси потенциальных вставок, и в результате образуется целый набор клонов, из которого путем скрининга и отбора получают нужные рекомбинантные молекулы. Скрининг и отбор можно значительно упростить, если обогатить исходную смесь нужным сегментом; в этом случае для выявления искомого рекомбинанта приходится проверять значительно меньше рекомбинантных клонов. С одной стороны, для конструирования рекомбинантных ДНК можно использовать очищенные фрагменты ДНК, а с другой - само молекулярное клонирование является наиболее простым и эффективным способом очистки фрагментов. Клонирование представляет собой также наиболее эффективный способ получения большинства фрагментов геномной ДНК в значительных количествах.

Существует три источника вставок для клонирования:

1) геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, либо физическими методами, например с помощью ультразвука;

2) синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или ферментативным методом либо путем объединения этих двух методов;

3) сегменты ДНК, полученные с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro. При расщеплении ДНК эндонуклеазами часто образуются фрагменты, способные к непосредственному лигированию с подходящими липкими или тупыми концами вектора. В других случаях соответствующие концы присоединяют к фрагментам перед лигированием.

б. Вставки геномной ДНК

Эндонуклеазное расщепление. Наиболее прямой способ получения вставок состоит в расщеплении суммарной геномной ДНК какого-либо организма или вируса с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Метод отличается высокой воспроизводимостью: специфический фермент разрезает данную ДНК с образованием уникального набора фрагментов. Если при эндонуклеазном расщеплении образуются липкие концы, соответствующие концам векторной молекулы, то клонирование осуществляют сразу или после обогащения популяции фрагментами для получения нужной вставки.

Обогащение смеси нужными фрагментами. Для эффективного разделения сложных смесей фрагментов используют два метода: электрофорез в полужидкой среде и жидкостную хроматографию высокого разрешения с обращенной фазой. Однако ни один из этих методов не позволяет получить фрагменты в чистом виде. Обычно препараты содержат примеси других фрагментов, имеющих близкую длину или обладающих такой же способностью к элюции. Тем не менее можно получить значительное обогащение смеси в отношении нужного фрагмента, что облегчает его выявление в большой коллекции клонов.

При электрофорезе и хроматографии разделение фрагментов ДНК основывается на их различии по размеру и нуклеотидному составу. Если размер генома невелик, то образуется относительно небольшое число хорошо разделяющихся фрагментов; их легко выделить, собрав нужные фракции элюата с хроматографической колонки или вырезав кусочки агарозного геля. Однако если расщепляется крупный геном, то хорошо отделяются лишь некоторые фрагменты. Чаще получается непрерывный набор фрагментов всевозможных размеров. Чтобы понять, в чем тут дело, проведем простой расчет. Типичный гаплоидный геном млекопитающих содержит примерно 3*109 п. н. Грубую оценку числа фрагментов, образующихся при исчерпывающем расщеплении эндонуклеазой, можно получить, разделив размер генома на предполагаемое среднее расстояние между двумя соседними сайтами для данной рестриктирующей эндонуклеазы. Для фермента, узнающего участок из шести пар оснований, среднее расстояние между сайтами будет равно 46 п. н. Если размер сайта узнавания равен четырем парам нуклеотидов, то он будет встречаться примерно один раз на каждые 44 п. н. При расщеплении ДНК млекопитающих ферментами, которые разрезают молекулу по сайтам узнавания длиной шесть пар нуклеотидов, образуется примерно 7*105 уникальных фрагментов, а ферментом, сайт узнавания которого составляет четыре пары нуклеотидов, - 12*106 фрагментов. В результате получается непрерывное распределение фрагментов по длинам. При этом некоторые фрагменты вообще невозможно выявить, поскольку они представлены в очень малом количестве.

Идентификация специфических фрагментов. Проблемы, возникающие при идентификации фрагментов. При расщеплении примерно 50 мкг геномной ДНК и последующем электрофорезе препарата масса сегмента ДНК длиной 1000 п. н., встречающегося в геноме лишь один раз, составляет всего 17*10-6 мкг, или 17 пг. Как идентифицировать этот специфический фрагмент? Если имеется гомологичная ДНК или препарат комплементарной РНК, которые можно использовать в качестве зонда при гибридизации, то интересующий нас фрагмент можно обнаружить при отжиге зонда с фрагментами после их денатурации. Так, в качестве зонда можно использовать очищенную мРНК, соответствующую гену, который мы хотим клонировать. Иногда в роли зонда выступает гомологичный ген, клонированный в другом организме и имеющий достаточно близкую структуру. Чтобы выявить гибрид, нужно использовать меченый зонд. Чаще всего его метят радиоактивным изотопом.

Определив примерный размер интересующего нас фрагмента, можно элюировать материал соответствующей области другого геля, не прошедшего гибридизацию, и использовать этот материал для клонирования. Аналогичным образом можно тестировать фракции после хроматографического разделения фрагментов на колонке.

Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных описанным выше, ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подходящую подложку. Этот метод широко используется, например, для идентификации специфических РНК и белков после их электрофоретического разделения. Блоттинг ДНК назван по имени его изобретателя блоттингом по Саузерну; соответствующие методики для РНК и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга.

Гибридизация меченого зонда с фрагментами ДНК, находящимися в геле, происходит очень неэффективно. Поэтому перед отжигом фрагменты переносят из геля на более подходящую твердую подложку, обычно на нитроцеллюлозный фильтр или нейлон. Сначала гель обрабатывают щелочью, чтобы произошла денатурация ДНК. Затем на него накладывают твердую подложку и пропускают через гель буферный раствор. В результате фрагменты ДНК переходят на подложку с сохранением их взаимного расположения. Далее инкубируют подложку в растворе, содержащем 32Р-зонд, при такой ионной силе и температуре, которые обеспечивают образование водородных связей между зондом и комплементарным фрагментом ДНК. Чувствительность метода зависит от удельной радиоактивности зонда и позволяет зарегистрировать фрагменты, когда их количество измеряется пикограммами. Например, 32Р-меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, имеют удельную радиоактивность более 100 имп. /мин на 1 пг, что достаточно для визуализации радиоавтографов.