Причины, по которым ядра клеток взрослых животных и даже поздних эмбрионов остаются тотипотентными, пока точно не установлены. Решающую роль играет взаимодействие ядра и цитоплазмы. Содержащиеся в цитоплазме животных вещества принимают участие в регулировании экспрессии клеточного генов ядра[5].

Работы М. ди Бернардино и Н. Хоффера показали, что цитоплазма ооцитов амфибий содержит факторы, восстанавливающие тотипотентность ядер дифференцированных соматических клеток. Эти факторы реактивируют репрессированные участки генома.

В 1985 г. была описана технология клонирования костных рыб, разработанная советскими учеными Л.А. Слепцовой, Н.В. Дабагян и К.Г.Газарян. Зародыши на стадии бластулы отделяли от желтка. Ядра клеток зародышей впрыскивали в цитоплазму неоплодотворенных икринок, которые начинали дробиться и развивались в личинки. Эти эксперименты показали, что потеря ядром тотипотентности в процессе онтогенеза связана не с утерей генов, а их репрессией. При культивировании соматических клеток in vitro частота тотипотентности ядер увеличивается. Генетический механизм стабильной репрессии генома дифференцированных клеток не выяснен, способы восстановления тотипотентности не разработаны, поэтому в основном ведется клонирование путем трансплантации ядер эмбриональных клеток.

Пересадки ядер у млекопитающих начались позднее, в 80-х годах. Это было связано с техническими трудностями, так как зигота млекопитающих имеет небольшие размеры. Например, диаметр зиготы мыши приблизительно 60 мкм, а диаметр оплодотворенной яйцеклетки лягушки около 1200 мкм, т.е. в 20 раз больше[26].

Несмотря на перечисленные трудности, первые сообщения о получении клонов мышей, идентичных донору, появились уже в 1981 году. В качестве донора были использованы эмбриональные клетки одной из линий мышей, взятые на стадии бластоцисты. Достоверность полученных данных вначале была поставлены под сомнение, так как воспроизвести результаты проведенных экспериментов в других лабораториях не удавалось, однако пару лет спустя Дж. Мак Грат и Д. Солтер также достигли успеха. В этих экспериментах клоны мышей удавалось получить лишь в том случае, если трансплантировали ядра эмбрионов на стадии не позднее 2 бластомеров. Было показано, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность развиваться только до стадии морулы. Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.

В начале пути

1883 — Открытие яйцеклетки немецким цитологом Оскаром Гертвигом.

1943 — Журнал Science сообщил об успешном оплодотворении яйцеклетки "в пробирке".

1977 — Профессор зоологии Оксфордского университета Дж. Гордон клонирует более полусотни лягушек.

1978 — Рождение в Англии Луизы Браун, первого ребёнка "из пробирки".

1985 — 4 января в одной из клиник северного Лондона родилась девочка у миссис Коттон — первой в мире суррогатной матери (зачата не из яйцеклетки миссис Коттон).

1987 — Специалисты Университета имени Дж. Вашингтона, использовавшие специальный фермент, сумели разделить клетки человеческого зародыша и клонировать их до стадии тридцати двух клеток (бластов, бластомеров).

Дж. Гордон

Первые успешные опыты по клонированию животных были проведены в середине 1970-х годов английским эмбриологом Дж. Гордоном (J. Gordon) в экспериментах на амфибиях, когда замена ядра яйцеклетки на ядро из соматической клетки взрослой лягушки привела к появлению головастика. Это показало, что техника трансплантации ядер из соматических клеток взрослых организмов в энуклеированные ооциты позволяет получать генетические копии организма, послужившего донором ядер дифференциированных клеток. Результат эксперимента стал основанием для вывода об обратимости эмбриональной дифференцировки генома по крайней мере у земноводных[18].

2. Клонирование животных

В своем эксперименте Кэмпбелл и его коллеги извлекли из эмбриона овцы на ранней стадии развития (на стадии эмбрионального диска) клетку и вырастили культуру клеток, то есть добились того, что клетка размножилась в искусственной питательной среде. Полученные генетически идентичные клетки (клеточная линия) сохранили тотипонентность. Затем ученые взяли яйцеклетку овцы-реципиента, тщательно удалили из нее весь хромосомный материал и добились ее слияния с тотипотентной клеткой из культуры. Полученные синтетические эмбрионы выращивали до стадии морулы-бластулы, а затем имплантировали в матку овцы. В результате удалось вырастить нескольких нормальных ягнят, которые были генетически идентичны.

В принципе, после того, как получена устойчивая линия тотипонентных клеток, ничто не мешает вносить в них генетические изменения. Например, перестраивая или удаляя отдельные гены, можно создавать трансгенные линии овец и других сельскохозяйственных животных. Однако прежде чем эта технология найдет практическое применение, предстоит решить еще множество проблем.

Пока число клонированных животных очень мало по сравнению с числом исходных эмбрионов, из клеток которых удавалось получить культуру. Многие клетки погибали, не успев достичь стадии бластоцисты. Не ясно, вызван ли высокий процент неудач разнообразными вредными факторами, воздействующими на клетку при манипуляциях с нею, или гетерогенностью самой клеточной линии. Последнее менее вероятно, поскольку процент успешных случаев не меняется при пересевах культуры. Для прояснения этого вопроса необходимо исследовать другие тотипотентные клеточные линии.