Для успешного выделения РСВ важно избегать замораживания и оттаивания образцов, при их хранении поддерживать достаточно низкую температуру, как можно быстрее использовать материал для заражения чувствительной культуры и включать в состав культуральной среды ЭТС или БСА. Сыворотка взрослых домашних животных, обычно используемая для культивирования клеток, как правило, содержит достаточно высокий титр нейтрализующих РСВ антител; поэтому ее нельзя использовать при выделении этого вируса. Зараженную культуру инкубируют при 36-37 °С и наблюдают за ней не менее 3 нед, регулярно меняя среду. Для выявления ЦПД могут потребоваться дополнительные слепые пассажи. Для РСВ характерно ЦПД в виде образования синцития, но этот эффект наблюдается не всегда, и его проявление зависит от штамма вируса и типа зараженной культуры.

1.4 Хранение вируса

Пневмовирусы следует хранить в интервале температур от -70°С до - 198°С. При - 20°С наступает достаточно быстрая потеря инфекционное™, и в таких условиях вирус нельзя хранить более 3 мес. Лиофилизация или добавление глицерина позволяют увеличить срок хранения вируса при - 20°С. Быстрота падения инфекционности зависит от природы содержащего вирус материала; так, вирус, связанный с мембранами, более стабилен, чем свободный.

2. Основные методы

2.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса

2.1.1 Чувствительные культуры клеток

Имеется большой набор клеточных линий, чувствительных к РСВ. В диагностических лабораториях чаще всего используют линию гетероплоидных клеток человека Нер-2, поскольку ее легко поддерживать.

Тем не менее для выделения РСВ более подходят диплоидные линии клеток человека, например эмбриональных клеток легких WI-38, HeL-1, L-4, L-49, HLDC-1, - 4, - 6 и эмбриональных клеток мозга НВС-1 и НВС-4.

РСВ размножается и в разнообразных культурах клеток животных, в частности в клетках почек кошек, норок и кенгуровой крысы. Степень чувствительности разных линий клеток, по-видимому, зависит от схемы пассирования используемого штамма вируса. Например, после трех пассажей через, индивидуальные бляшки на культуре клеток WI-38 полученный изолят вируса давал на этих клетках в 50 раз более высокий титр, чем вирус, пассируемый на клетках BS-C-1.

РСВ может быть адаптирован и к росту в некоторых первичных культурах клеток холоднокровных животных, например черепахи Testudo graced, но он не размножается в клетках земноводных и беспозвоночных, в частности комаров. В отличие от многих других парамиксовирусов РСВ не размножается в куриных эмбрионах и культуре клеток куриного эмбриона. Кроме того, в отличие от вируса пневмонии мышей он не размножается в клетках ВНК-21.

При серийном пассировании РСВ с высокой частотой образуются дефектные интерферирующие частицы. Разработан простой колориметрический метод обнаружения и количественного определения ДИЧ,

Для размножения РСВ в культуре клеток можно использовать основную минимальную среду Игла, желательно с дополнительными аминокислотами. Лучший выход вируса, как правило, дают активно делящиеся клетки. Можно использовать и другие среды, например среду Лейбовича, для поддержания рН которой не требуется газообразная СОг. Температура размножения РСВ составляет 25-39 °С; максимальный выход получают при температуре около 37°С.

2.1.2 Цитопатогенное действие

Характерное для РСВ цитопатогенное действие - это образование синцития. В синцитиях ядра клеток часто образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако формирование синцития наблюдается далеко не всегда; характер ЦПД определяется многими факторами, в том числе штаммом вируса, условиями культивирования и типом клеток. Например, при заражении клеток почек африканской зеленой мартышки образуются фокусы агрегированных клеток. Под агаровым покрытием они выглядят как интенсивно окрашенные сгустки клеток, напоминающие фокусы трансформации, индуцируемые онкогенными вирусами. Однако индуцируемые РСВ фокусы окружены слабо окрашенной областью (рис.2). Ее образование обусловлено миграцией клеток к формирующемуся скоплению. Фокусы состоят из увеличившихся в размерах разбухших клеток, которые затем дают начало синцитию. Несмотря на внешнее сходство фокусов, индуцируемых онкогенными вирусами и РСВ, клетки последних не сохраняют способность к делению.

2.1.3 Методы повышения инфекционное ™

Обработка вируса или клеток ДЭАЭ-декстраном повышает чувствительность клеток к РСВ. При оптимальной концентрации, равной 40 мкг/мл, ДЭАЭ-декстран в 2 раза повышает выход вируса; имеются данные и о том, что число клеток, зараженных РСВ крупного рогатого скота, возрастает в этих условиях в 11 раз. Нисевич и др. сообщили о 100-кратном увеличении числа клеток, зараженных РСВ человека, в присутствии 15 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана.

2.1.4 Методы стабилизации инфекционное

Инфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высоких концентраций сахарозы или ионов магния. Ферни и Герин сообщили, что в присутствии 1 М MgS04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увеличился до 12 нед. Добавление MgS04 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ для физико-химических исследований, однако при выделении вируса и определении его инфекционной активности добавление MgS04 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказывает отрицательное воздействие на культуры клеток.

2.2 Методы определения инфекционности

Инфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.

1. Высевают по 106 клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.

2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM.

В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.

3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °С для адсорбции вируса.

4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия. Удаление инокулята необязательно. В качестве покрытия можно использовать среду MEM, содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 °С среды MEM в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. При температуре 43-46 °С агар не застывает, и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.

5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39°С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации.

Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара.