Группа пневмовирусов
Содержание
1. Уникальные особенности пневмовирусов
1.1 Общее введение
1.2 Номенклатура
1.3 Выделение вируса
1.4 Хранение вируса
2. Основные методы
2.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса
2.1.1 Чувствительные культуры клеток
2.1.2 Цитопатогенное действие
2.1.3 Методы повышения инфекционное ™
2.1.4 Методы стабилизации инфекционное
2.2 Методы определения инфекционности
2.3 Гемагглютинация
2.4 Гемадсорбция
2.5 Иммунофлуоресцентные методы
2.6 Твердофазный иммуноферментный анализ
3. Аналитические методы
3.1 Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация
3.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках
3.1.2 Радиоиммуноанализ
3.1.3 Радиоиммунопреципитация
3.2 Метод выявления дефектных интерферирующих частиц
3.3 Электронная микроскопия
3.3.1 Морфология вирионов
3.3.2 Морфогенез вирионов
3.3.3 Сканирующая электронная микроскопия
3.3.4 Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков
3.4 Концентрирование вируса
3.5 Очистка и радиоактивное мечение РСВ
3.5.1 Градиентное центрифугирование
3.5.2 Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования
3.6 Радиоактивное мечение вирионной РНК
3.7 Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле
3.7.1 Анализ белков
3.7.2 Анализ РНК
3.8 Очистка матричной РНК для трансляции
3.9 Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвенирование
3.10 Очистка вирусных белков
3.10.1 Вирусные полипептиды
3.10.2 Очистка капсидного белка
3.10.3 Очистка вирионных гликопротеинов
4. Специальные биологические методы
4.1 Получение моноклональных антител
4.2 Выделение температурно-чувствительных мутантов
4.3 Получение персистентно инфицированных клеточных культур
1. Уникальные особенности пневмовирусов
1.1 Общее введение
В состав группы пневмовирусов входят респираторно-синцитиальный вирус человека, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей. Прототип этой группы, респираторно-синцитиальный вирус, - это плеоморфный оболочечный вирус, геном которого представлен несегментированной РНК негативной полярности. РСВ принадлежит роду Pneumovirus, который вместе с родами Paramyxovirus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae. Однозначно доказана этиологическая роль РСВ при ежегодных вспышках респираторных заболеваний у детей. Уникальность биологических, биохимических и клинических характеристик этого вируса не позволяет объединить его с представителями рода Paramyxovirus. РСВ обнаруживают у сельскохозяйственных животных; РСВ крупного рогатого скота вызывает у животных респираторное заболевание. Антитела к РСВ часто присутствуют и в сыворотке крови других домашних и лабораторных животных, контактирующих с человеком, но выделение вируса от этих животных не описано. Изоляты РСВ, выделенные от человека и крупного рогатого скота, имеют антигенное родство; среди человеческих изолятов не обнаружена связь между антигенной вариабельностью и клиникой заболеваний. Вирус пневмонии мышей, вызывающий у этих животных респираторное заболевание, не имеет антигенного родства с РСВ, однако в некоторой степени сходен с ним; во всяком случае это единственный вирус, достаточно близкий к РСВ, чтобы быть включенным в род Pneumovirus. Антитела к ВПМ с высокой частотой обнаруживаются в сыворотке крови человека; имеются неопубликованные данные, указывающие на то, что в лабораторные колонии мышей этот вирус попал от человека.
Основные свойства РСВ приведены в табл.1. РСВ отличается от других парамиксовирусов большим числом идентифицированных белков, порядком генов (имеются два гена неструктурных белков, один из которых расположен между З'-концевой лидерной последовательностью и геном нуклеопротеина, а другой - между гипотетическими генами гликопротеинов F и G), отсутствием гемагглютинина и нейраминидазы, а также характерными размерами нуклеокапсида и поверхностных выступов.
Таблица 1. Общие свойства пневмовирусов
|
Известные представители рода Нуклеиновая кислота Белки'> Вирионные ферменты Плавучая плотность частиц Морфология частиц Морфология нуклеокапсида Морфология мембранных выростов Генетические взаимодействия Стабильность Круг хозяев Патогенность Цитопатогенность |
РСВ человека РСВ крупного рогатого скота Вирус пневмонии мышей Однонитевая несегментированная РНК с коэффициентом седиментации 50S; мол. масса >5 - 10е 2 гликопротеина оболочки: гликопротеин G мол. масса 90 кД и связанные между собой дисульфидными связями продукты расщепления гликопротеина F 2 негликозилированных белка оболочки: белок матрикса мол. масса 26 кД и белок с неизвестной функцией мол. масса 24 кД 3 белка сердцевины: гипотетическая полимераза, нуклеокапсидный белок и фосфопротеин 3 неструктурных белка неизвестной функции РНК-полимеразная активность Гемагглютинин Нейраминидазная активность отсутствует 1.15-1,26 г/см3 Плеоморфные частицы диаметром 80^ - 500 нм и нитевидные частицы диаметром 60-ПО нм и длиной до 5 мкм. Спиральный тип симметрии, диаметр 12 - 13 нм Длина 10-12 нм 8 групп комплементации Рекомбинация или множественная реактивация не обнаружены Термолабильны, нестабильны при рН<3,0, чувствительны к замораживанию и оттаиванию In vivo, вероятно, ограничен Ассоциированы преимущественно с респираторными заболеваниями и спорадически с другими патологическими состояниями Образуют цитоплазматические, реже ядерные включения, часто формируют синцитии. Имеют склонность к персистенции |
1.2 Номенклатура
В англоязычной литературе для обозначения респираторно-синцитиального вируса имеет смысл использовать сокращение RS-вирус, а не RSV, чтобы отличать его от вируса саркомы Рауса, типичного представителя ретровирусов. Кроме того, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота следует отличать от не родственного ему синцитий-образующего вируса, также относящегося к ретровирусам.
1.3 Выделение вируса
В связи с необычной лабильностью РСВ и низким титром в секретах и зараженных тканях при выделении этого вируса требуется особая тщательность. Попытки выделения вируса из хранившихся образцов редко бывают успешными. Имеет смысл доставлять чувствительную культуру клеток непосредственно к месту нахождения пациента или зараженного животного, а не транспортировать содержащие вирус материалы в лабораторию для заражения культуры.
Чаще всего для выделения РСВ используют линии клеток Нер-2 и HeLa, однако описано использование культуры почек макак-резусов, линий BS-C-I, MRC-5, WI-38 и некоторых других. Лучшим материалом для выделения РСВ служат смывы слизистой носа или носоглотки больных детей. Смывы можно перенести в пробирку с небольшим количеством буферного раствора или бульона. Содержимое пробирок перемешивают энергичным встряхиванием. Образцы следует держать в ледяной бане и как можно скорее использовать для заражения чувствительной культуры клеток. Во всяком случае, промежуток между сбором материала и заражением культуры не должен превышать нескольких часов. Из антибиотиков наиболее часто используют пенициллин ', стрептомицин, неомицин и микостатин.
