Функции стрессовых гранул пока остаются непонятными. Можно предположить, что роль стрессовых гранул состоит в подавлении трансляции большинства матриц при избирательном отсутствии подавления трансляции определенных мРНК. Так, активно транслирующаяся при стрессе мРНК шаперона Нsp70 не включается в стрессовые гранулы. Синтез в клетках рекомбинантной укороченной формы белка ТIА-1, ингибирующей образование стрессовых гранул, одновременно усиливает трансляцию репортерной мРНК в клетках, подвергнутых стрессу. Стрессовые гранулы можно представить как «зал ожидания», в котором «пассажиры» - неполные инициаторные комплексы – терпеливо пережидают нелетную погоду.

I.6 Появление концепции «Мира РНК»

Действительно, РНК является уникальным биополимером, которому свойственны как функции ДНК, так и белков. Ее уникальные свойства быть как носителем наследуемой информации, так и возможность образовывать сложные трехмерные структуры, обладающие каталитической активностью, определяют то, что первичной молекулой могла быть РНК. Таким образом, в одной молекуле заложены как генотип, так и фенотип. Ключевым ферментом такого мира должен быть фермент РНК-репликаза, сделанный из РНК. Спектр реакций, выполняемых ферментами РНК – рибозимами – очень широк, поэтому в последнее время ведутся очень активные поиски новых рибозимов, способных осуществлять другие типы реакций.

I.6.1 Рибозимы

Рибозимы — не совсем ферменты: по своей химической природе это не белки, а тоже молекулы РНК, только выполняющие специальные функции. Они служат катализаторами при расщеплении и сшивании других молекул РНК. У рибозимов есть интересная особенность: максимум их активности приходится на низкие температуры. То есть они фактически обеспечивают низкотемпературный катализ.

Первые рибозимы, обнаруженные Альтманом и Чеком в 1982-1983 гг, были не особенно эффективны: они лишь разрезали и соединяли отдельные фрагменты целых молекул РНК. Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что эти ферменты могут катализировать и другие реакции. Джек Шостак, экспериментируя с модифицированными рибозимами, сумел выделить катализатор, способный соединять друг с другом короткие цепочки нуклеотидов. При этом использовалась энергия трифосфатных химических групп – тех самых соединений, которые и сегодня обеспечивают энергией биохимические реакции. Это обстоятельство подтвердило идею, что рибозимы могут функционировать сходным образом с современными белковыми ферментами.

У ряда видов примитивных эукариот (Tetrahymena thermophila и др.) гены рРНК содержат особые интроны (интроны группы 1), для которых характерен уникальный механизм сплайсинга. Такие интроны встречаются также в генах рРНК митохондрий, хлоропластов, дрожжей и грибов, однако они не выявлены в генах позвоночных животных. Изучение процессинга 26S рРНК тетрахимены (аналог 28S рРНК высших эукариот), выполненное Чеком и сотрудниками, привело к открытию особого вида сплайсинга, осуществляемого без участия каких-либо белков и получившего название аутосплайсинг (сплайсинг типа I).

Оказалось, что содержащаяся внутри 26S рРНК тетрахимены вставка (интрон) длиной 400 нуклеотидов способна сама осуществлять вырезание этого интрона и сшивание экзонов в присутствии Мg2+ и свободного гуанозина (либо его фосфорилированных производных). Таким образом была открыта аутокаталитическая функция РНК и положено начало изучению рибозимов.

Аутосплайсинг индуцируется гуанозином, гидроксильная группа которого атакует фосфатную группу на 5'-конце интрона, в результате чего разрывается межнуклеотидная (фосфодиэфирная) связь и высвобождается З'-конец экзона 1. Затем гидроксильная группа, содержащаяся на З'-конце экзона 1, атакует фосфатную группу на З'-конце интрона, что ведет к вычленению интрона и замыканию фосфодиэфирной связи между ОН-группой З'-конца экзона 1 и 5'-фосфатной группой экзона 2. Таким образом в результате реакции трансэтерификации без дополнительных затрат энергии осуществляется лигирование двух экзонов с образованием зрелой 26S рРНК. Вырезанный интрон затем циклизуется. Из его состава путем двухэтапного ауторасщепления освобождается фрагмент, содержащий 19 нуклеотидов, в результате чего образуется РНК длиной 376 нуклеотидов (L-19 IVS), которая и представляет собой истинный РНК-фермент (рибозим), обладающий каталитическими свойствами. Этот рибозим обладает устойчивой структурой, имеет эндонуклеазную активность, расщепляя длинные одноцепочечные РНК.

эукариотический хромосома рибонуклеиновый ген

Рис. 7. Схема аутосплайсинга у тетрахимены и процесс образования рибозима

Оказалось также, что рибозим L-19 IVS помимо нуклеазной обладает in vitro нуклеотидилтрансферазной (полимеразной) активностью и способен катализировать синтез олигонуклеотидов (олиго-С). Это указывает на возможность аутокаталитической репликации РНК и является одним из важных свидетельств в пользу существования «мира РНК». В структуре интронов типа I выявлены характерные внутренние олигопуриновые последовательности (у тетрахимены это последовательность GGАGGG), называемые адапторными последовательностями, которые участвуют в образовании активного центра РНК-ферментов и выполняют важнейшую роль в каталитическом расщеплении РНК.

Детальные исследования природных РНК-ферментов послужили мощным стимулом к моделированию и синтезу рибозимов заданного строения. Эти работы позволили установить, что каталитической активностью обладают не только крупные РНК (~ 400 нуклеотидов у тетрахимены), но и короткие 13 — 20-членные олигонуклеотиды, которые могут быть синтезированы in vitro. Такие рибозимы стали называть минизимами.

I.6.2 Возникновение древнего мира РНК

Именно открытие каталитически активных РНК – рибозимов привело к созданию концепции «мира РНК». Вскоре после открытия рибозимов Т. Чеком в одной из своих работ Ф. Крик писал: «Эти эксперименты (по каталитической РНК) поддерживают гипотезу, что биохимия РНК предшествовала традиционной биохимии, основанной на нуклеиновых кислотах и белках».

А Белозерский в 1957 году писал: «Нет никаких сомнений, что в процессе развития органического мира нуклеиновые кислоты играли значительную роль. Однако вряд ли на ранних этапах развития жизни возникли одновременно и РНК, и ДНК. Нам представляется, что возникновение рибонуклеотидов и затем РНК было первичным. ДНК возникла значительно позже и параллельно с усложнением функций и все большей дифференциацией протоплазмы».

Теперь можно было предположить, что молекулы РНК могли бы обходиться не только без ДНК как генетического вещества, но и без белков для осуществления катализа важных синтетических и метаболических реакций. Идея древнего безбелкового мира РНК как возможного предшественника современной жизни на Земле была окончательно сформулирована в 1986 г. и быстро приобрела многочисленных сторонников. В настоящее время гипотеза о том, что жизнь начиналась с молекул РНК и их ансамблей, является общепринятой. Таким образом, термин «мир РНК» широко используется теперь для обозначения древней, пребиотической ситуации на Земле, имевшей место около 4 млрд. лет назад, когда самореплицирующиеся молекулы РНК или их ансамбли могли существовать и эволюционировать без белков.