При изучении ответа лактозно-кислых бактерий на замораживание было установлено, что при замораживании культуры лактозно-кислых бактерий жизнеспособность клеток в значительно мере снижалась. В то же время, когда культуры бактерий перед замораживанием были предварительно подвергнуты в течение 2 часов холодовому шоку при 100C, значительно улучшалась жизнеспособность у штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis и Pediococcus pentosaceus PO2, но она не менялась у штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris и у штаммов Lactobacillus helveticus LB1 и Streptococcus thermophilus TS2. Жизнеспособность клеток возросла еще более, когда период холодового шока был продлен до 5 часов. Использование дегенерированных PCR пра меров, полученных как из гена важнейшего белка холодового шока Escherichia coli, так и Bacillus subtilis приводит к образованию PCR продуктов у всех изученных штаммов. PCR продукт из Lactococcus lactis ssp. Lactis M474 был клонирован и секвенирован. Вычисленная для этого белка последовательность аминокислот показала высокую гомологию с аминокислотными последовательностями других белков семе ства CSP. Использование PCR праймеров, основанных на последовательность M474, приводило к образованию PCR продуктов только у изученных штаммов лактококков, но не у изученных штаммов Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus или Pediococcus pentosaceus.

9. Гены протеинкиназ

Клон кДНК для гена рецепторо-подобно протеинкиназы был выделен из Arabidopsis thaliana. Этот клон длиной 1952 bp с открытой рамкой считывания размером 1623 bp кодирует пептид из 540 аминокислот, которы содержит четыре области, характерных для рецепторной киназы. Во-первых, он содержит характерную для киназ предполагаемую аминотерминальную сигнальную область последовательности. Во-вторых, он содержит область с пятью экстрацеллюлярными богатыми ле цином повторяющимися последовательностями. В-третьих, он имеет мембрано-связывающую область и, в-четвертых, домен цитоплазматическо протеинкиназы, который содержит все 11 субдоменов, характерных для протеинкиназ. Ген RPK1 экспрессируется в цветах, побегах, листьях и корнях. Показано, что экспрессия гена RPK1 индуцируется в течение 1 часа после обработки экзогенно абсцизовой кислотой. Ген также быстро индуцируется различными другими абиотическими стрессами, такими, как обезвоживание, высокая концентрация солей и низкая температура. Предлагается, что данный ген вовлечен в общий ответ клетки на стресс. Вызванная обезвоживанием индукция гена rpk1 не нарушается в дефицитных по эндогенно абсцизовой кислоте мутантах aba-1, abi1-1, abi2-1, abi3-1 и, вследствие этого, предполагается, что эта индукция не зависит от обработки абсцизовой кислотой.

10. Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду

Хранение клубне картофеля на холоду при 4 0C связано с

накоплением нескольких индуцируемых холодом транскриптов генов. Путем использования в качестве зонда ранее охарактеризованной кДНК был выделен и секвенирован соответствующий ген ci7.

Предполагаемы промотор ci7 содержит последовательность элементов, которая, как было показано, регулирует экспрессию индуцируемых холодом генов у Arabidopsis thaliana. Транскрипты CI7 дифференциальной экспрессируются в клубнях и листьях картофеля в ответ на холодовой стресс, засуху, высокую концентрацию солей или обработку экзогенно абсцизовой кислотой. В то время как накопление транскриптов CI7 во время хранения на холоду происходит в течение нескольких дне, индукция транскриптов CI7 в ответ на засуху, экзогенную абсцизовую кислоту и солевой стресс происходит быстро, в течение нескольких часов. Накопление белка CI7 в ответ на абиотические стрессы и обработку экзогенно абсцизовой кислотой в клубнях было небольшим, особенно по сравнению с уровнем содержания транскриптов. В листьях белок CI7 отсутствовал после всех исследованных воздействи. В ходе экспериментов растения S. tuberosum были трансформированы слитым с репортерным GUS-геном 5'-фланкирующим промоторным регионом ci7 размером 3 kb. Анализ клубне независимых трансгенных лини не обнаружил значительно индукции энзиматической активности GUS в ответ на низкотемпературное воздействие. В то же время, когда для анализа уровня индукции гена GUS с введенным ci7 промотором был использован РНК блоттинг, гетерологичное слияние GUS сильно индуцировалось в ответ на низкие температуры. По сравнению с РНК блот-анализом трансгенных растений, изучение ядерной «run-on» транскрипции ci7 гена показало, что большая часть температурно-регулируемо экспрессии гена ci7 в клубнях может быть связана с посттрансляционными механизмами контроля.

Анализ последовательности кДНК клона CI21, который соответствует другому индуцируемому холодом транскрипту, обнаруживает высокую гомологию с транскриптами томата и дикого картофеля, индуцируемыми созреванием и водным стрессом. Два гомологичных, неаллельных гена, ci21A и ci21B, были выделены и секвенированы. Нозерн-блот анализ показал, что самые высокие уровни содержания транскриптов ci21 обнаружены в хранимых в холоде клубнях. Более низкие уровни транскриптов содержатся в стеблях и корнях, и самые низкие уровни отмечены в листьях и клубнях, хранимых при комнатной температуре. Обработка растений абсцизовой кислотой, высокая концентрация соли и тепловой шок не оказывали значительного влияния на уровни содержания транскрипта ci21 в клубнях и листьях. Подсушивание было единственным стрессом, вызывавшим транскрипцию CI21 на листьях, но оно не вызывало ее в клубнях. Вестерн-блот анализ обнаружил белок CI21 только в клубнях. Химерный ген, созданный путем слияния предполагаемо области промотора ci21A и репортер-геном uidA, тестировался на индукцию бета-глюкуронидазы низко температуро в трансгенных картофельных растениях, при этом в ответ на хранение клубне при 4 0C у трансгенных растений наблюдалось двукратное увеличение активности бета-глюкуронидазы.

11. Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции

В ходе исследований экспрессии генов семейства Y-бокс белков, регулирующих процессы транскрипции в клетках, было установлено, что высококонсервативный элемент основы промотора grp78 играет важную роль в индукции grp78 под разнообразными стрессовыми сигналами. Предшествующее изучение установило функциональную область в 3' конце основы промотора, которая проявляет стресс-индуцируемые изменения в стрессированных ядрах. В ходе экспериментов показано, что человечески фактор транскрипции YY1 связывает SICR и трансактиваторный элемент основы промотора в условиях стресса. Скрининг библиотек с данным элементом промотора выявил два новых связывающих эту область промотора белка, YB-1 и DBPA. Оба белка принадлежат к семейству Y-бокс белков, для которых характерен эволюционно- устойчивы ДНК-связывающий мотив - домен холодового шока. В ходе исследований в экспериментах по ко-переносу было установлено, что Y-бокс белки выступают в стрессированных клетках антагонистами WI-опосредованного управляемого grp78 усиления транскрипции. Таким образом, белки, имеющие домен холодового шока, могут быть частью механизма передачи сигнала стресса у млекопитающих.