W. Goodwin с соавторами при изучении озимого рапса изолировали кДНК и выделили ген, кодирующий гибридный богаты пролином белок. Предполагаемы белок по структуре является модульным. При анализе его аминокислотной последовательности установлено, что N-терминальная область данного белка имеет свойства сигнального пептида, который может направлять белок в эндоплазматический ретикулум. Последовательность аминокислот от 27 до 287 имеет три области, которые содержат высокие уровни содержания пролина и нескольких других аминокислот, часто встречающихся в богатых пролином белках клеточной стенки. Эти области характеризуются повторяющимся аминокислотным мотивом. С-терминальная область содержит три предполагаемых мембранно-связывающих участка и имеет высокую степень сходства с аминокислотами некоторых разновидностей гибридных богатых пролином белков. На основе этих данных авторы делают вывод, что данный белок секретируется из клетки, размещается в клеточной стенке и заякоривается в плазматической мембране посредством С-терминально области. В ходе экспериментов установлено, что транскрипты, кодирующие данный белок, индуцируются в ткани листа в течение 8 ч обработки холодом и их содержание быстро снижается при возвращении растения к нормальным температурам. В то же время установлено, что транскрипты не индуцируются тепловым шоком, обезвоживанием, экзогенно абсцизовой кислотой или раневым стрессом, тогда как транскрипты контрольного гена B. napus индуцируются обезвоживанием и экзогенно абсцизовой кислотой.

При изучении экспрессии генов кукурузы были выделены кДНК и соответствующий геномный клон члена семейства генов, кодирующих a-субъединицу фактора элонгации трансляции 1. Предсказанная аминокислотная последовательность из 447 остатков прерывается в гене одним интроном. Саузерн-блот анализ показал, что клонированный ген ef1a - один из семейства, состоящего, по меньше мере, из шести генов. Как показал нозерн-блот анализ, содержание мРНК данного белка в листьях кукурузы увеличивается при низко температуре, в то время как в корнях уровень мРНК ef1 о резко уменьшается. Эти результаты показывают, что экспрессия EF1 о дифференцированно регулируется в листьях и корнях во время холодового стресса.

5. Гены дегидринов и гены индуцируемые экзогенной абсцизовой кислотой

Одними из наиболее изученных семейств генов, индуцируемых низко температурой, являются гены дегидринов и гены, индуцируемые экзогенно абсцизовой кислотой. Гены данных семейств к настоящему времени обнаружены практически во всех изученных видах растений - как травянистых, так и древесных.

При селективном исследовании с использованием первичных антител против богато лизином области дегидринов библиотеки кДНК, созданной из закаленных тканей коры персика, было обнаружено, что некоторые клоны обладают высоко степенью сходства с дегидринами. Нозерн-блоттинг с использованием клона 5А показал, что 1,8 kb участок экспрессировался сезонно и в листопадных, и в вечнозеленых генотипах, а также индуцировался водным дефицитом. Вечнозеленые и листопадные генотипы значительно различались как по их способности к холодовой акклиматизации, так и по сезонно экспрессии транскриптов и белков дегидринов. У обоих генотипов максимум экспрессии транскриптов был отмечен зимо и они не обнаруживались в мае - июле. Экспрессия белков была сходна с экспрессией транскриптов, в то же время экспрессия белка в вечнозеленом генотипе значительно увеличивалась после накопления транскриптов. Полученные данные указывают на то, что во время холодовой акклиматизации могут существовать различные уровни регуляции дегидринов. В ходе исследований авторами также был изолирован клон G10a, содержащий полны ген дегидрина, обозначенный ppdhn1. Этот ген кодировал белок из 472 аминокислот с предсказанным размером 50020 Да. Кодируемы белок содержит девять богатых лизином повторов, характерных для дегидринов и два DEYGNP мотива. Генный блот с использованием зонда к клону 5а показал, что в персике имеется один или два высокогомологичных гена.

При изучении белков, экспрессирующихся в ответ на низкие температуры у Brassica napus, был очищен до почти гомогенного состояния рекомбинант из белка BN28 и была определена его структура. Антитетела, полученные против rBN28, были использованы для характеристики рекомбинантного и нативного белков. Похожи на многие другие индуцируемые низко температурой белки, BN28 необычайно гидрофилен и термостабилен настолько, что остается в растворе после кипячения. Иммуноблот-анализ клеточных фракци показал, что BN28 не был ассоциирован с клеточными мембранами и находился исключительно в растворимой фракции клетки. Хотя ранее предполагалось, что BN28-подобные белки из Arabidopsis thaliana должны обладать антифризной активностью, такая антифризная активность не была определена при рекристализации льда с rBN28.

Из библиотеки кДНК, изготовленной из акклиматизированных к холоду этиолированных проростков рапса был изолирован клон, соответствующий регулируемому холодом гену. Анализ последовательности и поиски гомологи показали, что этот ген кодирует белок, гомологичный с ATP-зависимой фосфоенолпируват карбоксикиназой из Saccharomyces cerevisiae,

Trypanosoma, Rhizobium sp., и Escherichia coli. Аналог из B. napus был обозначен как BnPEPCK. Потенциальный ATP-связывающий сайт, существующи во всех белках PEPCK, также обнаруживался и в BnPEPCK. Хотя в ходе исследований и была установлена конститутивная экспрессия BnPEPCK в контрольных проростках при комнатно температуре, было также установлено, что уровень содержания копи его мРНК статистически достоверно повышался при 4 0C и уменьшался до контрольного уровня, когда проростки возвращались на контрольную температуру. Использование антител, полученных против рекомбинантного гистидин-BnPEPCK слитого белка, продемонстрировало, что уровень содержания белка BnPEPCK коррелирует с накоплением транскриптов Bnpepck.

Для экспериментов, имеющих целью понять механизмы развития морозоустойчивости, индуцированной экзогенно абсцизовой кислотой, были использованы культивируемые клетки эмбрионов озимой пшеницы. Культивируемые клетки обрабатывались 50 M абсцизовой кислоты в течение 5 дне при 23 0С для достижения максимального уровня морозоустойчивости. Возросшая морозоустойчивость обработанных экзогенно абсцизовой кислотой клеток была тесно ассоциирована со значительным накоплением в плазматической мембране полипептида с молекулярно массой 19 кДа. 19-кДа полипептидны компонент был выделен путем препаративного гель-электрофореза и далее разделен на мажорную и минорную полипептидную компоненту при помощи Трицин-SDS-PAGE. Была определена N-концевая аминокислотная последовательность AWPM-19 и при помощи PCR из библиотеки, выделенной из обработанных экзогенно абсцизовой кислотой культивируемых клеток, был выделен клон кДНК, кодирующий 18.9 кДа гидрофобный полипептид AWPM-19, с четырьмя мембранно-связываемыми доменами и щелочной точко pI. Экспрессия мРНК wpm-1 сильно индуцируется обработкой в течение нескольких часов 50 мМ абсцизовой кислоты. Эти результаты показывают, что AWPM-19 должен быть тесно связан с индуцируемым экзогенно абсцизовой кислотой увеличением морозоустойчивости у культивируемых клеток пшеницы.