Из листьев закаленной к холоду капусты был выделен и очищен белок, который защищал тилакоиды незакаленного шпината от повреждения при замораживании. Процедура выделения включала в себя осаждение тепловой обработкой, осаждение сульфатом аммония и гликозаминогликаном гепарина, а также колоночную хроматографию на Полиамиде 6 и обращенно-фазную хроматографию на матриксе С-18. После обращенно-фазной хроматографии на электрофорезе была выявлена одна полоса с приблизительной молекулярной массой 7 кДа. Эта фракция имела криопротекторную активность. Гель-фильтрация подтвердила, что данный белок является мономером с молекулярной массой 7 кДа. Этот белок можно выделить только из закаленных к холоду растени капусты, но не из растени, выращенных в незакаливающих условиях. С использованием меченых пероксидазой лектинов было показано, что данный криопротектин является гликопротеином и содержит связанны остаток а1–3 связанной фукозы.

Листья омелы содержат тригалактозу и специфические N-ацетилгалактозаминные-изолектиновые группы. Группы ML I и ML III показали высокую криозащитную активность в изолированных мембранах тилакоидов шпината в период замерзания и оттаивания почвы, в то время как ML II не обладали такой активностью. В ходе экспериментов установлено, что криозащитная эффективность белков коррелировала с их относительно гидрофобностью. Было установлено также, что морозостойкость листьев омелы сезонно регулируется природными условиями. В то время как листья, собранные зимой, не повреждались при замерзании почвы до -200 C, листья, собранные в июле, претерпевали 70% утечку электролита после замерзания почвы до -50 C. Данные экспериментов свидетельствуют, что и количество фракций ML I и ML III изменяется в течение года. Наиболее высокое содержание этих криозащитных лектинов наблюдалось зимой и ранней весной, а наиболее низкое – в период летних месяцев. Изменений в содержании ML II не было зафиксировано. Эти данные подтверждают то, что некоторые лектины могут играть роль в стабилизации клеточных мембран под действием стрессовых условий окружающей среды.

При изучении влияния развития морозоустойчивости на синтез белков было идентифицировано семейство белков, ассоциированное с развитием морозоустойчивости у пшеницы. Данное семейство белков специфическое для злаков и их содержание регулируется низко температурой. Антитела, полученные против белка с мол. массой 50 кДа, реагируют, по крайней мере, с пятью членами данного семейства. Используя эти антитела, были определены содержание и локализация данного семейства белков в акклиматизированных к холоду всходах пшеницы. Вестерн-блоттинг субклеточных частиц показал наличие всех членов семейства в цитозоле и очищенных ядерных частицах. После 21 дня холодовой акклиматизации озимой пшеницы эти белки накапливались вплоть до 0.9% от всех растворимых экстрагируемых белков. Их клеточная концентрация составляла 1.34. Иммуногистохимическая локализация показала, что содержание этих белков наиболее высоко в зоне сосудистого перехода. Эти белки не были обнаружены в зрело ксилеме, в верхушечной меристеме побегов или в боковых корневых примордиях. Данная тканеспецифичная индукция позволяет предполагать, что чувствительные клетки в областях, где вода имеет тенденцию замерзать в первую очередь, для своей защиты требуют более высокого содержания этих белков.

Полученные данные хорошо соответствуют тому факту, что отрастание после замораживания в значительно степени зависит от жизнеспособности данной части побега. Электронно-микроскопический анализ с использованием иммунно-золотой метки показал, что эти белки присутствуют в цитоплазме и в нуклеоплазме. В то же время они не были найдены в клеточных стенках или других клеточных органеллах. Исследование криозащитного действия in vitro показало, что белок WCS120 так же эффективно, как БСА и сахароза, защищает лактатдегидрогеназу от денатурации в ходе замораживания. Эти результаты показывают, что данное семейство белков может быть вовлечено в общий механизм защиты растворимых частиц клетки. Их присутствие в нуклеоплазме также позволяет предложить как их возможную функцию – предохранение процессов транскрипции. Высокая гидрофильность, высокое содержание данных белков и устойчивость этих белков при кипячении позволяют предлагать, что они могут обеспечивать особую микросреду, необходимую для выживания клетки в чувствительно зоне сосудистого перехода во время стресса при замораживании.

При исследовании взаимосвязи ответов растения на различные типы стресса было обнаружено, что солевой стресс увеличивает морозоустойчивость у некоторых видов травянистых растений. С целью понять молекулярные основы увеличения индуцируемо холодовым стрессом морозоустойчивости при помощи двумерного электрофореза в ПААГ был проанализирован эффект обработки солевым раствором на состав общих белков растений картофеля. После 24 часовой обработки NaCl, во время которой холодоустойчивость возросла в три раза, были выявлены девять индуцируемых солевым стрессом белков. Прямое сравнение этих белков с белками, индуцируемыми низкотемпературным стрессом и экзогенно абсцизовой кислотой, позволило установить, что пять индуцируемых солевым стрессом белков индуцировались также низкотемпературным стрессом, а семь – обработкой абсцизовой кислотой. Три белка 13/7.0, 27/6.6 и 48/6.9) индуцировались и холодом и экзогенно абсцизовой кислотой и были связаны с изменением морозоустойчивости. После 6 часов обработки солью, перед тем как развивалась холодоустойчивость, эндогенны уровень абсцизовой кислоты в листьях кратковременно увеличивался в шесть раз. Результаты позволяют считать, что солевая индукция холодового закаливания включает синтез холодоиндуцируемых и индуцируемых абсцизовой кислотой белков, а также то, что изменение белкового синтеза можно связать с увеличением концентрации абсцизовой кислоты в ответ на солевой стресс. Эти данные также позволяют предполагать, что некоторая часть белков, индуцируемых холодом и абсцизовой кислотой, связана с солевым стрессом.

2. Влияние гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях бактерий и водорослей

Изменение экспрессии водорастворимых белков в ответ на понижение температуры наблюдается также и у водрослей и у бактерий. Во время резкого понижения температуры в бактериях временно экспрессируются на высоком уровне «индуцируемые холодом белки». При помощи двумерного электрофореза в ПААГ были идентифицированы некоторые из этих белков. Несмотря на это, общие функции данных белков, как ответа организма на холодовой шок, в настоящее время все еще неясны. В последнее время наибольшее внимание исследователей сфокусировано на группе «белков холодового шока», синтез которых, как было показано, в значительно степени индуцируется во время холодового шока и после него и которые играют важную регуляторную роль в физиологии адаптации микроорганизмов к низким температурам. E. Coli, B. Subtilis и B. Cereus обладают семейством белков, насчитывающим, по меньшей мере, 3 – 7 белков CSP – небольших кислых белков, которые имеют между собой более 45% идентичности в последовательности аминокислот. Последние данные подтверждают, что члены этого широко распространенного семейства белков могут in vitro действовать как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Тем не менее, все функции CSP остаются неизвестны. К тому же, в соответствии с недавно полученными данными, в индукции синтеза CSP также играет важную роль посттрансляционная регуляция. В этот процесс могут быть также вовлечены рибосомы. Это предположение находится в соответствии с моделью, в которой, как предполагается, рибосомы являются температурным сенсором в бактериях.