Введение

1. Обзор литературы

1.1. Отличия ДНК-белковых от РНК-белковых взаимодействий

Двойная спираль ДНК – это регулярная структура, в которой наиболее существенные отличия между соседними участками заключены в последовательности пар оснований. В обоих желобках специфический сайт ДНК для узнавания белком может быть сформирован сетью водородных связей между основаниями нуклеотидов. Большой желобок спирали ДНК доступнее для контакта, что создаёт возможность для дискриминации последовательностей в нём [39]. Основанный на этом предположении механизм узнавания «прямым считыванием» был подтверждён для многих ДНК-связывающих белков. Также было отмечено потенциальное значение и «непрямого считывания». Некоторые последовательности ДНК могут иметь изменения в конформации сахаро-фосфатного остова или даже быть деформированы в необычные структуры. В таком случае специфичность связывания может определяться контактами белка с остовом ДНК [40]. Индуцированные белком нарушения структуры ДНК довольно обычны и могут варьировать по форме от небольших изгибов, как в сайте нуклеазы EcoRI, до больших изгибов и выведения оснований из стэкинга, как в комплексе с ТАТА-связывающим белком [24].

Механизм «прямого считывания» предполагает, что ДНК-белковыми контактами, определяющими специфичность связывания, являются водородные связи с основаниями и гидрофобные контакты с тиминовыми метилами, в то время как энергия неспецифического связывания обеспечивается ионными и водородными связями с сахаро-фосфатным остовом. В «непрямом считывании» могут принимать участие и другие виды взаимодействий, например, в комплексе с ТАТА-связывающим белком ДНК контактирует с гидрофобной белковой поверхностью и ароматические аминокислоты интеркалируются в спираль ДНК [24].

Молекулы РНК отличаются от ДНК несколькими особенностями, которые влияют на возможности белкового узнавания. Во-первых, в РНК участки Уотсон-Криковских спиралей часто прерываются выпячиваниями, внутренними петлями и шпильками. Исследования часто встречающихся «четырёхнуклеотидных» шпилек и консервативных внутренних и шпилечных петель рибосомной РНК, методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа выявили специфические нерегулярные структуры, содержащие неканонические пары и выпячивания. Во-вторых, спирали РНК достаточно короткие, обычно меньше полного оборота, и имеют А-форму, отличную от В-формы ДНК. А-форма спирали имеет очень глубокий и узкий большой желобок, что создаёт стерические затруднения для взаимодействия с белками. Однако прилегающий к нерегулярным участкам большой желобок может быть доступен для связывания [41].

Следствием этих отличий является то, что белки оказываются перед значительно большим разнообразием водородных связей и возможностей стэкинга нуклеотидов в случае РНК, чем это возможно в стандартной спирали ДНК. Дополнительной и весьма важной особенностью РНК является возможность «третичных» взаимодействий, которые могут соединять различные участки РНК и создавать сложные структуры. Классическими примерами являются соединение спиралей тРНК в «L-образную» молекулу, обнаруженная в интронах группы I «аденозиновая платформа», открывающая спираль РНК для стэкинга с другой спиралью РНК [12], и структура двух взаимодействующих петлями транскриптов RNA I и RNA II плазмиды ColE1, так называемый «kissing» комплекс [27]. Тот факт, что благодаря вторичным и третичным взаимодействиям может быть создана уникальная структура РНК, повышает вероятность специфического взаимодействия белков только с сахаро-фосфатным остовом. Эта ситуация может быть крайним случаем «непрямого считывания», когда основания нуклеотидов обеспечивают белковое узнавание только определением общей конформации РНК, а не прямыми контактами с белком.

Таким образом, искажение регулярной структуры нуклеиновой кислоты, по всей видимости, более важно для узнавания РНК, чем для ДНК. Спираль ДНК довольно стабильная структура, в то время как неспаренные нуклеотиды и петли дестабилизируют структуру РНК. Комбинация богатого выбора нерегулярных структур в РНК и возможности деформации её структуры позволяют предположить, что РНК-связывающие белки будут использовать более широкий выбор стратегий связывания, чем ДНК-связывающие белки, и что механизм узнавания «непрямым считыванием» будет среди них более широко распространён.

1.2. Ранние представления об РНК-белковых взаимодействиях

1.2.1. РНК-связывающие структурные мотивы в белках

Изучение свойств РНК-связывающих белков привело к обнаружению в этих белках ряда и консервативных мотивов. Их открытие позволило начать классификацию РНК-связывающих белков, исходя из их структурных особенностей, а также предсказывать РНК-связывающие свойства белков [8]. В настоящее время выделяют следующие основные мотивы:

РНП (ribonucleoprotein) мотив - наиболее распространён, состоит из двух коротких последовательностей РНП1 (октамер) и РНП2, разделённых примерно 30 аминокислотами [17].

S1 мотив – в состав входит пять антипараллельных b-тяжей. Ряд консервативных ароматических и заряженных аминокислот, расположенных в петле между тяжами b1 и b2, в середине b2, в конце b3 и в повороте между b4 и b5 находятся поблизости друг от друга и, вероятно, формируют РНК-связывающий участок домена [10].

Домен холодового шока – состоит из пяти b-тяжей с РНП-последовательностью, расположенной в одном из тяжей и структурно очень схож с S1 мотивом [38].

КН мотив – содержит стабильную baabba структуру.[11] Точная роль мотива в РНК-связывании неизвестна.

Мотив DSRM – имеет abbba топологию. Возможный участок связывания находится в петле между b-тяжем и С-концевой a-спиралью [9].

RGG мотив – содержит 20-25 аминокислот и обычно имеется в комбинации с РНК-связывающими мотивами других типов. Он состоит из близкорасположенных поворотов Arg-Gly-Gly (RGG), расположенных среди других, часто ароматических аминокислот [8].

Мотив ARM – состоит из 10-20 аминокислот с большим количеством аргинонов. Встречается в вирусных и фаговых белках.

Домены с «цинковыми пальцами» - содержит последовательности СХ4СХ12НХ3-4Н и соответствующее число ионов цинка, связанные цистеинами и гистидинами [17].

Другие РНК-связывающие мотивы. Существует ряд других консервативных последовательностей, не имеющих гомологии с уже перечисленными мотивами. Например, мотив белка-аттенюатора триптофанового оперона из B.subtilis. [2].

1.2.2. Взаимодействия белков с тРНК

Вопрос о том, как аминоацил-тРНК-синтетазы достигают высокой специфичности в узнавании тРНК, вероятно, был одним из первых серьёзно изучаемых вопросов в проблеме РНК-белковых взаимодействий. Чтобы взаимодействовать со всеми компонентами трансляционного аппарата, все тРНК должны иметь достаточно схожую трёхмерную структуру, что значительно затрудняет для каждой из 20 синтетаз выбор своих изоакцепторных тРНК из пула тРНК клетки. В связи с этим, возможности к дискриминации весьма ограничены и, в основном, сведены к узнаванию нуклеотидов в специфических позициях.