б) к 5-10 мг продажного препарата ДНК прибавляют 1 мл 0,4%-ного раствора NaOH, перемешивают. Из полученного раствора отбирают 0,3-0,5 мл раствора дифениламина и ставят на кипящую водяную баню на 10 мин. Жидкость приобретает синий цвет вследствие взаимодействия дезоксирибозы, образовавшейся в результате гидролиза ДНК, с дефиниламином;

в) к 10 мг продажного препарата РНК прибавляют 1 мл 0,4%-ного раствора NaOH, перемешивают. К 0,5 мл щелочного раствора РНК добавляют 0,5 мл раствора дифениламина и ставят пробирку на кипящую водяную баню на 15 мин. Развивается зеленая окраска жидкости вследствие взаимодействия рибозы с дефиниламином.

3. Серебряная проба на пуриновые основания. К 1 мл гидролизата дрожжей приливают 2 капли концентрированного раствора аммиака и 5 капель 1%-ного раствора азотнокислого серебра. Через 3-5 мин выпадает бурый осадок серебряных соединений пуриновых оснований.

4. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 1 мл гидролизата дрожжей прибавляют 5 капель молибденового реактива и осторожно кипятят несколько минут. Развивается лимонно-желтая окраска жидкости вследствие образования фосфорномолибденовокислого аммония по реакции

HPO + 12 (NH)MoO + 21 HNO (NH)PO 12 MoO + + 21 NHNO + 12 HO

2.2. Определение нуклеозидфосфатов методом тонкослойной хроматографии

Оборудование и реактивы: СФ; хроматоскоп; весы; рефрижераторная центрифуга; камера для тонкослойной хроматографии; пластинки Silufol uv 254; ножницы; фарфоровые ступки; пробирки; микропипетки; градуированные пипетки на 1 и 2 мл; мерный цилиндр на 100 мл; препаровальная игла. Пропанол; 25%-ный раствор аммиака; жидкий азот; 5%-ный раствор ТХУ кислоты; 0,1 н. HCl; стандартные 0,01 М растворы АТФ, АДФ, АМФ.

Материалы: проростки; ткани животных.

Ход работы

Навеску (0,5 – 1 г) растительной или животной ткани измельчают ножницами на холоду, заливают жидким азотом и растирают в ступке. Затем к растертому порошку приливают 1 мл 5%-ной ТХУ кислоты, перемешивают и центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин при 0 - 4° С. Надосадочную жидкость сливают в пробирку, к осадку приливают еще 1 мл 5%-ной ТХУ кислоты, перемешивают и центрифугируют. Супернатанты объединяют и используют для хроматографии. На пластинки Silufol uv 254 в нижней части, отступив 2 см, наносят в виде полосы 0,03 – 0,05 мл насадочной жидкости. После подсыхания ставят в сосуд для восходящей хроматографии. В качестве растворителя используют систему н-пропанол – 25%-ный аммиак – вода (60 : 30 : 10). Время разделения около 2 ч. Затем вынимают хроматографические пластинки, высушивают на воздухе и просматривают в хроматоскопе (светофильтр УФС-1).

Нуклеотиды располагаются в порядке снизу вверх: АТФ, АДФ, АМФ. Зоны, в которых обнаруживаются нуклеотиды, обводят препаровальной иглой, соскабливают в пробирки и экстрагируют 1,8 мл 0,1 н. HCl, интенсивно встряхивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость фотометрируют в кювете шириной 3 мм при длине волны 257 нм против контроля. Контролем служит соскобленный с пластинки сорбент из золы, не содержащий нуклеотидов; с ним поступают в дальнейшем так же, как с золами, в которых обнаружены нуклеотиды.

Содержание нуклеотидов рассчитывают по калибровочным графикам, составленным для каждого нуклеотида по формуле

C=

где D – оптическая плотность; В – общий объем экстракта, мл; К – коэффициент экстинкции (равный для АТФ, АДФ, АМФ соответственно 14,6 10, 15,0 10, 14,7 10); А – объем нанесенного экстракта, мл; n – навеска, г.

Заключение

В результате выполненной курсовой работы можно сделать вывод, что структурными блоками гигантских молекул нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Каждый нуклеотид содержит три различных компонента: азотистое (пуриновое или пиримидиновое) основание, моносахарид пентозу (рибозу или дезоксирибозу), остаток фосфорной кислоты. Эти компоненты соединены друг с другом в такой последовательности: азотистое основание пентоза — фосфат. Соседние нуклеотиды соединены друг с другом посредством эфирной связи между моносахаридом и фосфатом другого нуклеотида.

Гидролиз нуклеиновых кислот, выделенных из ядер клеток, показал, что они состоят из пуриновых и пиримидиновых оснований (аденина, гуанина, цитозина, тимина), дезоксирибозы и фосфорной кислоты. Эта кислота была названа дезоксирибонуклеиновой (ДНК). Из дрожжей была получена другая нуклеиновая кислота, содержащая вместо дезоксирибозы рибозу. Ее назвали рибонуклеиновой кислотой (РНК). В нее входят основания — аденин, урацил, цитозин и гуанин. ДНК и РНК ответственны за хранение, репликацию (воспроизведение), транскрипцию (перенос) и трансляцию (передачу) генетической (наследственной) информации.

Уникальны биологические функции нуклеотидов. Помимо того, что нуклеотиды входят в состав нуклеиновых кислот, они выполняют важную функцию в энергетическом (фосфорном) обмене, в аккумулировании химической энергии и ее переносе; служат активными простетическими группами в окислительно-восстановительных ферментах, играют важную роль в синтезе жиров, олиго- и полисахаридов.

На основе правил Чаргаффа и данных рентгеноструктурного анализа, Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили двухспиральную модель ДНК и развили важную для биохимии концепцию комплементарности. Они предложили три уровня структуры ДНК: первичную (последовательность нуклеотидов), вторичную (структура двух правозакрученных спиралей), третичную (дополнительное закручивание в пространстве двухспиральной молекулы). В образовании вторичной и третичной структур важную роль играют водородные связи, возникающие между парами оснований аденин — тимин и гуанин — цитозин, а также гидрофобные взаимодействия между основаниями, направленные вдоль цепей молекулы ДНК. Разрушение этих связей нагреванием или подщелачиванием растворов вызывает денатурацию ДНК.

Точное копирование молекулы ДНК (ее репликацию) обеспечивает так называемый полуконсервативный механизм, заключающийся в расхождении двух цепей материнской ДНК и использовании их в качестве матриц для синтеза двух новых (дочерних) цепей ДНК, Этот механизм доказан экспериментально.