а (в) — проявителем на альдозы — анилинфталатом (анилиноксалатом):

Полосу, опрыснутую резорцинфосфатом, прогревают 3—4 мин. в сушильном шкафу при температуре 85—95ºС. Пятна фруктозы, сахарозы, раффинозы и олигосахаридов, содержащих фруктозу, окрашиваются в интенсивно розовый цвет. При нагревании хроматограммы, опрыснутой раствором хлормочевины, в течение 5 мин. при 105 ºС пятна альдоз принимают синее окрашивание. Полосу, обработанную раствором анилинфталата или анилиноксалата, нагревают при 105—110 ºС. При обработке хроматограммы анилинфталатом глюкоза и галактоза проявляются в течение 5 мин. при 105°С в виде желтовато-коричневых пятен; пятна пентоз вишнево-красного цвета. Мальтоза и лактоза дают желто-коричневые пятна при нагревании в течение 20 мин. при 105 ºС. При проявлении анилиноксалатом (110°С, 5—6 мин.) пятна альдоз имеют коричневое окрашивание. Проявленные контрольные полосы (а), (б) и (в) прикладывают к основной части хроматограммы (в) и таким образом определяют положение пятен отдельных сахаров на полосе (в), не проявляя ее. Участки бумаги, содержащие не проявленные пятна глюкозы, фруктозы, сахарозы и олигосахаридов, вырезают, разрезают на маленькие кусочки («лапшу») и элюируют сахара водой три раза по 30 мин. при 60—70°. Элюаты фильтруют через маленькие бумажные фильтры, выпаривают на водяной бане до небольшого объема, снова фильтруют и доводят до определенного объема. В растворе определяют содержание сахара с помощью антронового реактива.

Определение восстанавливающих сахаров колориметрическим методом (по И. С. Лурье)

Метод основан на взаимодействии восстанавливающих сахаров при нагревании со стандартным щелочным раствором красной кровяной соли. При этом ее часть восстанавливается в желтую кровяную соль.

С6Н12О6 + 2K3[Fe(CN)6] + 2KOH = СН2ОН(СНОН)4СООН + 2K4[Fe(CN)6] + Н2О

Избыток феррицианида определяют на фотоэлектроколориметре по характерному поглощению в области 420 .440 нм (синий светофильтр). Расчет восстанавливающих сахаров ведут по калибровочной кривой. Метод удобен для серийных анализов и применим в тех случаях, когда испытуемый раствор не содержит других веществ, взаимодействующих с феррицианидом, а также веществ, имеющих поглощение в данной области спектра. При работе с биологическим материалом, исследуемые вытяжки бывают очень сложны по своему составу, часто опалесцируют, поэтому требуется определенная подготовка образца. Метод очень удобен для изучения накопления восстанавливающих сахаров под действием ферментов, гидролизующих углеводы, в экспериментах, моделирующих технологический процесс. В этом случае исследователя интересует не абсолютное содержание восстанавливающих сахаров, а их увеличение за счет ферментативной реакции. При этом факторы, влияющие на величину оптической плотности, нивелируются контрольными или нулевыми замерами.

Реактивы и материалы: а) 1 %-ный раствор феррицианида (10 г в 1 дм3). б) 1,25 н. раствор КОН (70 г в 1 дм3). в) 1 %-ный исходный раствор глюкозы. г) 0,1 %-ный и 0,2 %-ный рабочие растворы глюкозы.

Ход работы.

1.Выполнение анализа: В коническую колбу на 100 см3 вносят 10 см3 раствора феррицианида, 5 см3 раствора щелочи и от 1 до 5 см3 испытуемого раствора. Если объем пробы меньше 5 см3, то недостающее количество компенсируют водой. Колбочку прикрывают часовым стеклом и на слабом огне доводят до кипения. Кипятят ровно 1 минуту. Затем содержимое колбочки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность на ФЭКе при синем светофильтре (420 нм). Количество сахара в испытуемом растворе определяют по калибровочной кривой.

2.Построение калибровочной кривой: Концентрацию исходного раствора глюкозы устанавливают по методу Бертрана. Для этого берут три пробы по 5 см3 1 %-ного раствора глюкозы, добавляют к каждой пробе по 15 см3 воды и 40 см3 реактива Феллинга. Концентрацию исходного раствора глюкозы рассчитывают как среднее значение из трех параллельных определений. Точную концентрацию рабочих растворов глюкозы рассчитывают по данным анализа исходного раствора. Сухие конические колбочки на 100 см3 заполняют согласно табл. 2.

Взаполненных колбочках проводят определение содержания глюкозы колориметрическим методом и строят калибровочную кривую в координатах «оптическая плотность — количество глюкозы, мг».

Определение восстанавливающих сахаров методом Шомадьи — Нельсона (предшественник метода Фолина-Ву)

Колориметрический метод Шомадьи — Нельсона основан на реакции восстанавливающих сахаров с реактивом Шомадьи — Нельсона, в результате которой образуется окрашенное соединение «молибденова синь» общего состава MonO3n-x голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию восстанавливающих углеводов, которые определяют по величинам оптических плотностей при 508 нм, по калибровочной кривой, составленной с применением модельных растворов. Метод неспецифичен, трудоемок.

Реактивы и материалы: а) Реактив Шомадьи.

a 24 г карбоната натрия и 12 г тартрата калия — натрия (калий натрий виннокислый средний) помещают в коническую колбу вместимостью 500 см3 и добавляют 250 см3 дистиллированной воды. Затем приливают 40 см310 % раствора сульфата меди, перемешивают и добавляют 16 г гидрокарбоната натрия.

b.18 г Na2SO4 растворяют в 500 см3 горячей дистиллированной воды. Раствор кипятят в течение 40 минут для удаления СО2, затем охлаждают.

Cмешивают (a+b) в мерной колбе на 1 дм3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. В течение первых двух-трех суток хранения реактива Шомадьи оседает небольшое количество меди с примесями. Этот осадок отфильтровывают, готовый раствор хранят в темной склянке.

б) Реактив Нельсона.

a 25 г модибдата аммония помещают в мерную колбу на 500 см3 и растворяют в 150 см3 Н2О. Раствор перемешивают, к нему осторожно небольшими порциями добавляют 21 см3 концентрированной H2SO4 (х. ч.) при непрерывном перемешивании.

b 3 г гептагидрата гидроортоарсената натрия (Na2HAsO4 • 7Н2О) растворяют отдельно в химическом стаканчике в 50 см3 Н2О

(a+b). Получается прозрачный раствор светло-желтого цвета, его доводят до метки водой и выдерживают в термостате при 37 "С в течение 2 суток. После выдержки раствор готов к употреблению.

Ход работы.

1.Проведение анализа: К 1 см3 испытуемого раствора добавляют 1 см3 реактива Шомадьи, перемешивают и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 15 минут:

СuSO4 + 2NaOH [гидролитический] ¾¾® Cu(OH)2 + Na2SO4

Затем к охлажденной смеси добавляют 1 см3 реактива Нельсона и доводят объем до 10 см3 дистиллированной водой: