Отбор штаммов проводили по методике, представленной в [41].

Музейную культуру, хранящуюся в холодильнике при t 4-80С на агаризованной среде, наносят на твердую минеральную среду с добавлением раствора глюкозы и метилфосфонатов кальция, железа и алюминия и выращивают посевной материал в течение 3-4 суток при t 28-290С. Затем по образующимся ореолам прозрачности вокруг нанесенной культуры отбирают штаммы микроорганизмов, способные улучшать растворимость метилфосфонатов.

Состав питательной среды:

В состав среды входят следующие соли (г/л): NH4Cl – 10,0; MgSO4x7H2O – 2,0; NaCl – 1,0; агар – 20г; трис(гидроксиметил)аминометан – 1,0.

Источник углерода – 40 % раствор глюкозы из расчета 1мл/л.

20 мл питательной среды переносят в пробирку и добавляют метилфосфонаты в виде взвеси концентрацией 1 г/мл.

2.2 Методика культивирования микроорганизмов

Используют стандартную методику культивирования с использованием органофосфонатов в качестве источников фосфора.

Для культивирования микроорганизмов используют среду MS1.

В состав минеральной части среды входят следующие соли (г/л): NH4Cl – 2,0; MgSO4x7H2O – 0,2; K2SO4 – 0,5 и микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O – 2,5; CaCl2 x6H2O – 10,0; CuSO4x5H2O – 2,0; H3BO3 – 0,06; ZnSO4x7H2O – 20,0; MnSO4xH2O – 1,0; NiCl2x6H2O – 0,05; Na2MoO4 x2H2O – 0,3.

Источник углерода – глутамат Na 10 г/л.

Источник фосфора – МФК или метилфосфонаты в концентрации 0,3 г/л. Кислые эфиры – в концентрации 0,2 г/л.

Для приготовления минеральной среды MS1 по 10 мл стоковых растворов 1-5 последовательно вносят в 0,5 л дистиллированной воды, тщательно перемешивая после добавления каждого из них, доводят рН до 6,5 20% NaOH и добавляли дистллированную воду до 1 л. Среду разливают по 100 мл в колбы для культивирования и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм 30 мин. В стерильную среду перед засевом бактерий вносят 70 мл стерильного стокового раствора 1М глутамата Na, 300 мл МФК на 1 литр среды. Начальное значение рН среды должно составлять 7.0-7.5.

Для приготовления твердой среды MS1 добавляют к вышеописанной жидкой среде агар-агар 18 г/л, стерилизуют в подобных условиях. Глутамат и МФК вносят после расплавления среды перед разливом в чашки Петри.

Музейную культуру, хранящуюся в холодильнике при t 4-80С на агаризованной среде MS1 с МФК, штрихом пересевают на твердую минеральную среду MS1 с теми же источниками фосфора и выращивают посевной материал в течение 2-3 суток при t 28-290С.

Состав стоковых растворов:

Стоковый раствор 1. Растворить последовательно в 0,7л дистиллированной воды следующие навески (г): NH4Cl – 200.0, MgSO4x7H2O – 20.0, CaCl2 x6H2O – 1.0, довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 2. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды навеску (г): K2SO4 – 50.0. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 3. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды навеску (г): FeSO4x7H2O – 0,25. Довести рН до 4.0 20% H2SO4. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 4. Растворить последовательно в 0,5 л дистиллированной воды навески (г): CuSO4x5H2O – 0,2; ZnSO4x7H2O – 2,0; MnSO4xH2O – 0,1; NiCl2x6H2O – 0,005. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

Стоковый раствор 5. Растворить последовательно в 0,5 л дистиллированной воды навески (г): H3BO3 – 0,006; Na2MoO4 x2H2O – 0,03. Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

2.3 Методика проведения эксперимента по изучению возможности

деструкции метилфосфоновой кислоты и её эфиров

На поверхность чашки наносили 30-40 мл стерильной минеральной среды MS1 без источника углерода и фосфора, суспендируют клетки, собирают суспензию стерильной пипеткой и переносят в стерильную колбу. Туда же добавляют 7 мл стерильного стокового раствора 1М глутамата Na и инкубируют на качалке в течение 1-2 суток для получения клеток голодных по фосфору. Изменение значения рН в суспензии контролируют путем нанесения капли жидкости на полоску универсальной индикаторной бумаги. Это значение поддерживают на уровне 7.0 - 8.0 добавлением 20 % H2SO4 .

Культивирование бактерий проводят в 750 мл колбах на качалке со 180-200 об/мин при t 28-290С. Засев среды производят суспензией голодных по фосфору с исходной оптической плотностью 0,1-0,15 ед. Для этого определить исходную оптическую плотность суспензии бактерий и провести необходимое разбавление до плотности 0,1-0,15 ед. В колбы, содержащие 100 мл жидкой среды MS1 добавляют 7 мл стерильного стокового раствора 1М глутамата Na и МФК или метилфосфонатов кальция, железа и алюминия из расчета 0,3 г на 1 л смеси. Изопропилового, изобутилового и пинаколилового эфиров из расчета 0,2 г на 1 л смеси.

Отбор проб для анализов проводят через 12 часов с обязательным контролем значения рН культуральной жидкости. Поддержание оптимального для роста значения рН 7.0-8.0 осуществляют путем внесения 20% стерильного раствора H2SO4 , либо 20% стерильного раствора NaОН.

Каждый опыт проводят минимум два раза, в опыте берут количество колб для культивирования также минимум в двух повторностях.

2.4 Методика контроля роста микроорганизмов

Рост культуры контролируют:

а) по изменению оптической плотности при длине волны 560 нм (ОП560) в кювете 1 см. на спектрофотометре. Пересчет оптической плотности на вес сухой биомассы проводили согласно коэффициенту 0,5 (г сухих клеток/ед оптической плотности), полученному экспериментально для бактериальных культур, выделенных из почвы.

б) по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) путем высева из разведений на агаризованную среду LB. Последовательно культуральную жидкость разводят до необходимого разведения (10-6-10-8 клеток/мл). Для разведения использовали стерильный физ. раствор. Из пробирки с необходимым разведением берут 100 мкл культуральной жидкости, которую наносят на агаризованную среду LB и тщательно растирают шпателем. Чашки помещают в термальную комнату (t 28-290С) на 2-3 суток. Затем подсчитывали количество колоний.

Состав среды LB: дистиллированная вода -1 литр, бакто-пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl –5 г, агар-агар – 18г, рН 7.0. Стерилизация: автоклавирование при 0,5 атм, 30 минут.

Для расчета скорости роста строят кривую роста, выраженную в логарифмах. По кривой роста определяли длину лаг-фазы и логарифмическую фазу роста.

Удельную скорость роста рассчитывают по формуле:

m = (ln ОП2 - ln ОП1)/(t2 – t1) час-1

Экономический коэффициент мг органофосфонатов/г биомассы рассчитывают по формуле:

Q = D/(A/2),

где Q - экономический коэффициент, мг органофосфонатов/г биомассы;

А - оптическая плотность в стационаре;

D - количество метаболизируемой МФК.

2.5 Методика определения концентрации соединений с С-Р связью

Метод определения фосфат-иона основан на образовании окрашенного комплексного соединения между фосфором, молибдатом аммония и малахитовым зеленым в сильно кислой среде. Количество фосфора рассчитывают по результатам измерения поглощения образующегося комплексного соединения при длине волны 645 нм на фотоколориметре.