Перед начинающим хроматографистом проблема выбора типа разделительной системы (эксклюзионной, ион-парной, адсорбционной или другой) и подбора условий, с которыми лучше эту систему использовать для анализа необходимой ему смеси веществ, встает сразу же после того, как он получает эту смесь. Решить этот вопрос тем более сложно, чем менее известно вещество или вещества, с которыми предстоит работать, чем сложнее по составу проба, чем меньше опыт у хроматографиста и его возможность воспроизвести методику, описанную в литературе (отсутствие необходимых колонок и сорбентов, растворителей высокого качества, детектора, градиента растворителя и т.п.). Многое зависит от того, располагает ли хроматографист такими-то чистыми стандартами, оборудованием и методиками для очистки сложных по составу проб, особенно медицинских и биологических, от мешающих анализу примесей (взвесей, полимерных веществ, солей и др.).

Как правило, надо стремиться подбирать условия разделения по принципу — от простого к сложному.

Если вещество, с которым предстоит работать, не является уникальным (они встречаются достаточно редко), прежде всего, следует собрать о нем всю возможную информацию: к какому классу веществ относится, какова его формула, молекулярная масса, какие есть функциональные группы, в чем растворяется, какова температура кипения, показатель преломления, УФ-спектр, растворимость в различных растворителях и другое.

Когда информация о веществе или веществах собрана, следует провести тщательный литературный поиск с использованием реферативных журналов, оригинальной литературы, картотек, каталогов и собрать всю информацию о методиках анализа этого вещества как ВЭЖХ, так и родственными методами (ГЖХ, ТСХ, колоночной хроматографией). Попутно необходимо собрать информацию о методах очистки и подготовки проб. Собранную информацию следует заносить на карточки и хранить в картотеке. Если информация о веществе очень скудна или же полностью отсутствует, следует собирать информацию о наиболее близких по свойствам классах веществ. Когда весь собранный литературный материал обработан и систематизирован, нужно выбрать ту из методик, которая наиболее соответствует имеющемуся оборудованию, наиболее проста для исполнения и для воспроизведения которой есть все условия (колонки, сорбенты, растворители, реагенты).

Начинать следует с подготовки хроматографической системы. Ее следует тщательно проверить, приготовить нужный растворитель, промыть, уравновесить колонку с новым растворителем. Если возможно, после этого ввести тестовую смесь, чтобы убедиться в том, что колонка и вся система в целом наводятся в рабочем состоянии. Уравновешивание колонки с растворителем следует проводить до тех пор, пока параметры удерживания тест-веществ не станут совершенно стабильными. Затем следует перейти к анализу. На начальном этапе работы не следует увлекаться высокой чувствительностью детектирования, за исключением только тех случаев, когда исследователь не располагает чистыми стандартами и вынужден сразу работать с образцами, чистота которых вызывает сомнение. Однако и в этих случаях лучше провести очистку до ВЭЖХ, использовав метод ТСХ или другой.

Установив на детекторе среднюю чувствительность, следует по одному ввести в инжектор растворы всех имеющихся и представляющих интерес чистых веществ (стандартов), фиксируя каждый раз время выхода, форму пика, наличие примесей и все отклонения от нормы, которые замечены. Если полученные результаты близки к тем, которые получены в методике, взятой в литературе, порядок выхода пиков тот же и форма их правильная, следует проанализировать наиболее чистую из проб, с которыми предполагается работать. Если в дальнейшем предполагается работать с загрязненными пробами, очистка которых затруднена или невозможна, нужно защитить колонку от возможного загрязнения и выхода из строя путем установки после инжектора предколонки. Следует учитывать, что предколонка, заполненная пелликулярным материалом, имеет малую емкость по загрязнениям, тогда как заполненная микрочастицами размером 5 или 10 мкм—существенно большую. Установка предколонки, заполненной микрочастицами, изменяет время удерживания веществ пробы, поэтому при ее установке следует повторить ввод чистых стандартов и идентификацию компонентов в пробе.

Если все вещества, которые вас интересуют, выходят достаточно быстро и с хорошим разрешением, можно переходить к калибровке по искусственным смесям и начинать количественную работу. Если же выходят не все вещества, следует попытаться добиться их элюирования, увеличив силу растворителя. Полезно, если есть возможность, для сокращения объема поиска использовать градиент растворителя от слабого до наиболее сильного. При этом не следует забывать два положения: во-первых, колонка должна быть промыта от тяжелых компонентов предыдущих проб, анализировавшихся изократически, сильным растворителем; во-вторых, всегда следует проверить отсутствие ложных пиков при градиенте, введя вместо пробы чистый растворитель. Если исследователь не располагает возможностью применить градиент, следует использовать метод поиска от самого сильного растворителя к слабому.

При использовании для анализа обращенно-фазного варианта работы, подайте на колонку наиболее сильный растворитель, например метанол, уравновесьте с ним колонку (и вымойте все остатки от предыдущих проб, анализировавшихся с более слабым растворителем). Затем введите пробу (еще лучше, стандарт), наиболее трудно элюирующуюся. Если компонент элюируется слишком быстро (например, с нулевым объемом), значит, растворитель слишком сильный.

Уравновесьте колонку с более слабым растворителем (например, метанол — вода в соотношении 80:20) и повторить ввод пробы. Если результат тот же, переходите последовательно к соотношениям 60:40, 40:60, 20:80 до тех пор, пока не будет получено разделение достаточно хорошее с приемлемым временем элюирования всей пробы (k' последнего элюирующегося компонента не должно превышать 10). Если при этом полученная селективность (разделение некоторых компонентов) вас не удовлетворяет, можно испытать систему ацетонитрил — вода (с несколько меньшим содержанием ацетонитрила по сравнению с системой метанол—вода, в которой получено приемлемое время элюирования) — ее селективность несколько другая. Наконец, можно испытать и систему тетрагидрофуран— вода (со значительно меньшим содержанием тетрагидрофурана по сравнению с системой метанол—вода), хотя она значительно менее удобна (хуже работает в ближней УФ-области, более склонна к окислению). Наконец, имея селективность по всем трем системам обращенно-фазных растворителей, можно определить состав трехкомпонентного (или даже четырехкомпонентного) растворителя, обеспечивающий наилучшее разделение всех компонентов. Этим, однако, на практике пользуются редко, довольствуясь обычно двухкомпонентным растворителем наилучшей селективности.

При работе в нормально-фазном режиме с привитой фазой или в адсорбционном варианте уравновесьте колонку с более сильным растворителем, например с системой гексан—изопропанол в соотношении 100:10. Так же, как и в предыдущем случае, вводите пробу при этом составе растворителя; далее повторяйте несколько раз, каждый раз уменьшая элюирующую силу растворителя (ряд соотношений гексан — изопропанол 100:3, 100:1, 100:0,3 и 100:0,1 и т.д.) до тех пор, пока не будет достигнуто разделение с k' для последнего элюирующегося компонента 8—10. Если полученная при этом селективность вас не удовлетворяет, можно попытаться повторить эту работу, заменив модификатор на другой (например, ацетонитрил, метиленхлорид, уксусную кислоту и т.д.).