Наиболее характерным свойством аскорбиновой кислоты является ее способность давать химически и термодинамически обратимую ОВ-систему; с этим свойством обычно связывают ее физиологическую функцию.

Количественное определение аскорбиновой кислоты

Принцип метода.

Метод основан на редуцирующих свойствах аскорбиновой кислоты. Синяя краска (индикатор), 2,6-дихлорфенолиндофенол, восстанавливается в бесцветное соединение экстрактами растений, содержащими аскорбиновую кислоту (реакция Тильманса).

2,6-дихлорфенолиндофенол показывает два вида реакции. Один вид обусловливается изменением pH среды, как у обычных ацидометрических индикаторов; при этом происходит переход от интенсивного синего цвета в щелочной среде к бледнокрасному в кислой среде. Переход окраски происходит между рН 4 и 5, в этом интервале индикатор имеет фиолетовый цвет. Второй вид реакции – это ОВ-переход от темносинего окисленного состояния к бесцветному. Эту последнюю реакцию и используют для определения аскорбиновой кислот. Кислотные вытяжки из растений титруют раствором индикатора (известного титра) до наступления розового окрашивания, обуславливаемого избытком индикатора в кислой среде. На одну молекулу аскорбиновой кислоты (молекулярный вес 176) приходится две молекулы индикатора. При приготовлении этой краски получается натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола, имеющая молекулярный вес 290.

Точность метода во многом зависит от применяемой техники анализа. Так как аскорбиновая кислота является весьма лабильным веществом, то в растертой растительной ткани она быстро окисляется, превращаясь в дегидроаскорбиновую кислоту. Поэтому все операции, связанные со взятием средней пробы материала для анализа, измельчением и растиранием навески и т.п., должны быть выполнены возможно быстрее. Дегидроаскорбиновая кислота может быть определена после восстановления ее, например, сероводородом, что в значительно степени усложняет технику анализа. Дегидроаскорбиновая кислота в небольших количествах присутствует и в нерастертых тканях растений, но ввиду сравнительно незначительного содержания ее можно и не учитывать при выполнении массовых анализов культур и сортов на аскорбиновую кислоту.

При оценке свежего растительного материала не допускается предварительная сушка его или какой-либо друго способ консервирования, так как количество аскорбиновой кислоты при консервировании уменьшается.

Такие объекты, которые обладают очень короткой лежкостью (листовые овощи, мелкие плоды, ягоды и пр.), следует анализировать в день их сбора, так как изменения в содержании витаминов в них происходят быстро.

Реактивы и аппаратура.

1) 1-процентная соляная кислота (23 мл концентрированой соляной кислоты, удельного веса 1.19 доводят дистилированной водой до 1 л);

2) 2-процентная метафосфорная кислота (НРО3) ; 20 грамм кристаллической кислоты растворяют и доводят водой до 1л; она может хранится в холодильнике 2-3 недели, не подвергаясь порче; 1-процентный водный раствор щавелевой кислоты может заменить метафосфорную;

3) 2-процентная серная кислота; 11.4 мл концентрированной кислоты, удельного веса 1.84, доводят водой до 1 л;

4) аскорбиновая кислота, кристаллическая;

5) иодистый калий, кристаллический;

6) крахмал, 1-процентный раствор (как индикатор);

7) 10-процентный раствор сернокислой меди (9.25 г CuSO4 × 5H2O растворяют в 50 мл воды);

8) 0.001 н. раствор иодата калия (KJO3); на аналитических весах берут 0.3568 г иодата, высушенного в течение 2 часов при 102о, растворяют и доводят водой до 1л; полученный таким образом децинормальный раствор разбавляют в 10 раз и доводят водой до 1л; раствор удобно хранить в склянке со вставленной в нее микробюреткой, наполняющейся раствором снизу при помощи груши;

9) 0.001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола; на технических весах отвешивают 60 мг сухой краски, переносят в мерную колбу на 200 мл, прибавляют 100-150 мл теплой дистилированной воды и 4-5 капель 0.01 н. щелочи; сильно взбалтывают колбу руками 10 минут, затем доливают до метки водой и фильтруют через плотный фильтр в сухую колбу;

10) 2 микробюретки с градуировкой на 0.01 мл, емкостью 1-5 мл.

11) пипетки на 5 и 10 мл;

12) мерные колбы на 100, 200 и 1000 мл;

13) коническая колба на 100 мл;

14) мерный цилиндр на 50 мл;

15) химические стаканы на 50 мл;

16) стеклянная воронка;

17) часовое стекло

18) фарфоровые чашки диаметром 20 см;

19) ступка диаметром 15 см;

20) технохимические весы на 200 г;

21) нож из нержавеющей или хромированной стали.

Установление титра краски по аскорбиновой кислоте (по С.М.Прокошеву). Метод установления титра краски основан на параллельном титровании раствора аскорбиновой кислоты краской и 0.001 н. раствором иодата калия. Так как 1 мл 0.001 н. раствора иодата эквивалентен 0.088 мг аскорбиновой кислоты, то легко рассчитать титр краски.

Перед установлением титра краски растворяют несколько кристалликов аскорбиновой кислоты приблизительно в 50 мл 2-процентной серной кислоты. 5 мл этого раствора титруют краской из микробюретки. Тотчас же после этого такой же объем раствора аскорбиновой кислоты титруют из другой микробюретки точно 0.001 н. раствором иодата с прибавлением в колбочку перед титрованием нескольких кристалликов (около 5-10 мг) иодистого калия и 5 капель 1-процентного раствора растворимого крахмала. Применение больших концентраций иодистого калия недопустимо, ибо при высоких концентрациях этой соли сильно тормозится оксисление аскорбиновой кислоты иодом.

Подготовка материала.

Среднюю пробу предварительно грубо измельчают ножом на стеклянной пластине, либо фарфоровой чашке. Необходимо помнить, что следы железа и меди катализируют разрушение витамина С. Весь процесс измельчения необходимо выполнить как можно быстрее.

Из измельченного и хорошо перемешанного материала берут на часовые стекла две параллельные навески на технохимических весах для определения аскорбиновой кислоты. При одновременном анализе нескольких образцов следует стремиться все навески для определения аскорбиновой кислоты сразу залить кислотой и после уже растирать до образования гомогенной смеси.

Ход определения.

Приготовление вытяжек.

Навеску исследуемого материала в 5-10 г заливают в ступке 20 мл 1-процентной соляной кислоты и быстро растирают в присутствии кислоты до образования гомогенной массы. Процесс растирания не должен длиться больше 10 минут. Полученную массу сливают из ступки (через стеклянную палочку и воронку) в мерную колбу на 100 мл. Ступку споласкивают несколько раз 2-процентной метафосфорной кислотой, которую выливают в ту же мерную колбу. Содержимое колбы доводят до метки 2-процентной метафосфорной кислотой, колбу закрывают пробкой, сильно встряхивают и оставляют стоять около 5 минут. Затем содержимое колбы выливают на сухой фильтр и отфильтровывают часть экстракта (около 50 мл) в сухой стакан или колбу.

Соляная кислота извлекает из растительной ткани как свободную, так и связанную аскорбиновую кислоту. Метафосфорная же кислота осаждает белки и улучшает стойкость аскорбиновой кислоты в экстрактах.