г) Иммуноглобулины класса D. IgD также изучен недостаточно. Впервые он охарактеризован как четвертый класс иммуноглобулинов D.Rowe, G.Fahey (1965). Его молекулярная масса около 180000. Молекула IgD состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками (Vunnar, Fohansson, 1969, Spiegelberg, 1977, Ruddick, Leslie, 1977). Роль в организме человека почти не изучена. Полагают, что он - секреторный иммуноглобулин. Сывороточный IgD обнаружен только у человека и приматов. При электрофорезе в агаровом ге­ле подвижность IgD соответствует подвижностямb и a глобулинов. Точных экспериментальных данных о присутствии IgD у жи­вотных пока не имеется.

д) Иммуноглобулины класса Е. IgE впервые идентифицирован K. Ishisaka, F. Fshisaka (1966). Молекулярная масса IgЕ 190 000, константы седиментации 8 S. Молекула IgE также состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, молекулярная масса которых 22 600 и 72 500 соответственно. Содержание углеводов свыше 12% (Шаханина, Стоев, 1981). IgE играют важную роль в патогенезе аллергии (Isgizaka, Ishizaka, 1976, Dorrington, Bennich, 1978). К.Г.Стоев (1979) разработал методы выделения и количественного определения D и Е иммуноглобулинов в сыворотке крови здоровых и больных людей.

ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Для выделения иммуноглобулинов из сыворотки крови живот­ных, особенно G1, М и А, применяют различные методы получения предварительно очищенных белков, обогащенных соответствующими иммуноглобулинами. Дальнейшую очистку проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- сефадексе А-50, ДЭАЭ- целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацией на сефедексе G-200 или препаратным электрофо­резом.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОЧИЩЕННЫХ

ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

С этой целью обычно применяют методы предварительного вы­деления иммуноглобулинов.

ОСАЖДЕНИЕ 4 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА АММОНИЯ

4 М раствором сульфата аммония осаждаются все белки сыво­ротки, включая альбумин.

В этой фракции, содержится основная масса иммуноглобулинов G1 и G2 и значительное количество IgМ и IgА , хотя последние обычно обнаруживаются и в надсадочной жидкости. Поэтому оса­док, полученный 4 М раствором сульфата аммония, может служить источником приготовления всех классов иммуноглобулинов, что име­ет большое значение, особенно для выделения их из одной пробы сыворотки.

ОСАЖДЕНИЕ 2,78 М РАСТВОРОМ АММОНИЯ

К холодной сыворотке крови добавляют равный объем холод­ного 2,78 М раствора сульфата аммония, перемешивают при 40С 2 ч. Сладок растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждают еще 2 раза. При этом 2,78 М раствором сульфата аммония в основном осаждаются иммуноглобулины класса G. Причем , такая концентрация соли осаждает IgG2 и , что очень важно, наиболее полно IgG1 при минимальном осаждении фракций a- и b- глобулинов. Поэтому данный метод наиболее удобен для выде­ления иммуноглобулинов G1 и G2 как из сыворотки крови лошадей, так и овец и крупного рогатого скота.

ОСАЖДЕНИЕ 1,39 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА

АММОНИЯ ПУТЕМ ДИАЛИЗА

Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке помещают в 1,39 М раствор сульфата аммония, перемешивают в холодильнике магнитной мешалкой 2 суток при трехкратной смене раствора соли. Осадок дважды промывают 1,39 М раствором аммония.

При этом из сыворотки крови овцы и крупного рогатого скота осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, однако иммуноглобулин G1, a- и b- глобулины присутствуют лишь в следовых количествах. Из сыворотки крови лошадей, главным образом выделяется иммуноглобулин G2, IgG(Т) присутствует лишь в небольшом количестве.

Таким образом, препарат получаемый 1,39 М раствором суль­фата аммония путем диализа удобен для выделения IgG2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, однако наиболее чистый IgG2 получается из сыворотки крови лошадей.

ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ

К охлажденной сыворотке крови по каплям добавляют холод­ный 2,53 М раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1 М. Перемешивают 2 час в холодильнике, осадок раство­ряют и диализируют. 1 М раствором сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, практически свободные от фракции b-глобулинов. По нашим данным, этот метод достаточно прост и выгоден для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота. Недостаток метода в том, что такая концентрация соли не обеспечивает полного осаждения иммуноглобулина G1. По составу, препарат, выделяемый сульфатом натрия, идентичен препарату, получаемому 1,39 М раствором сульфатом аммония, поэтому он наиболее пригоден для выполнения иммуноглобулина G2.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50

Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50 типа средний (100-200 меш). Предварительную обработку и регенерацию ДЭАЭ -сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным буфером, рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с незначительными изменениями (Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).

Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле, где в зоне g -глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные g -глобулиновые фракции - IgG1 и IgG2, а иммуноэлектрофорезом, - три линии преципитации - IgG1, IgG2 и IgM. Таким образом, применив метод J.Baumstark et al (1964) не получили чистые фракции IgG1 и IgG2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, а только их смесь.

Следует подчеркнуть, что указанные авторы разработали способ выделения чистого IgG из нормальной сыворотки крови человека, испольэуя ДЭАЭ -сефадекс А-50 типа грубый и 0,01 М калий- фосфатный буфер рН, 6,5 . Однако З.С. Сеитов и Ж.Ж.Жумашев (1966) этим методом не смогли выделить иммунохимически чистый иммуноглобулин G2 из сыворотки крови лошадей. Им удалось выделить смесь белков состоящую из IgG2 и IgМ и IgА. Ана­логичные результаты получены при выделении IgG2 из из нормальной сыворотки овец (Ж.Ж.Жумашев, З.С.Сеитов, 1968 а, б).

Результаты, отличные от результатов Baumstark et al (1964), по-видимому , обусловлены особенностями белкового состава сыворотки крови этих видов животных. Таким образом, указанный метод - также способ предварительного выделения IgG2 из нормальной сыворотки крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение необходимо отметить, что американскому био­химику G.Edelman (1972) и английскому биохимику К.РогIgг (1972), работающим в области изучения человеческих иммуноглобулинов была присуждена Нобелевская премия 1972 года. Присуж­дение Нобелевской премии указывает на большое внимание мировой научной общественности к иммуноглобулинам и на достижение оп­ределенных успехов з изучении иммуноглобулинов человека.

Что касается иммуноглобулинов сельскохозяйственных живот­ных, то, к сожалению, многие вопросы выделения, идентификации и количественного определения этих защитных белков остаются еще слабо разработанными.