Количественное определение

1. Непосредственно колориметрированием желтых растворов рибофлавина.

2. По азоту. К 0,3 г рибофлавина (точная навеска), предварительно высушенного в течение 18 часов в вакуум-эксикаторе над серной кислотой, в кьельдалевской колбе прибавляют 1 г бензойной кислоты и определяют содержание азота, разрушая смесь не менее 5 часов. Содержание азота должно быть не менее 14,5% и не более 15,2%.

Витамин В6(Пиридоксин. Адермин)

(Мол. вес 205,6)

Качественные реакции

1. С фосфорно-вольфрамовой кислотой адермин образует нерастворимое соединение (осадок).

2. С хлорным железом адермин дает красное окрашивание.

3. Смешивают 1 мл 0,01%-ного раствора с 1 мл 0,04%-ного раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида в абсолютном алкоголе и затем прибавляют 1 каплю раствора аммиака — появляется синее окрашивание.

Количественное определение

1. Колориметрическое определение основано на превращении четвертичного основания в фиолетового цвета соединение типа кар-бопиридинцианина, которое колориметрируют, сравнивая со стандартом.

2. Солянокислую соль адермина можно определять титрованием раствором щелочи при индикаторе бромтимоловом синем; для проверки оттитрованную жидкость вновь титруют 0,1 н. раствором нитрата серебра.

Фолиевая кислота(Птероилглутаминовая кислота)

(Мол. вес 441,21)

Качественные реакции

1. Получение азокрасителя.

2. Спектр поглощения в ультрафиолете (при рН 11) имеет максимум при 255, 282 и 365 нм.

Количественное определение

При восстановлении фолиевой кислоты в солянокислом растворе цинковой пылью в числе других продуктов отщепляется пара-амино-бензойная кислота, которую диазотируют нитритом натрия. Полученная соль диазония сочетается с N-(1-нафтил)-этилендиаминди-гидрохлоридом в присутствии сульфамата аммония NH2SO2 ONH4

При этом наблюдается фиолетовая окраска раствора, интенсивность которой пропорциональна концентрации и измеряется в фотоколориметре или в спектрофотометре.

Требуются реактивы: 1) раствор желатины (1,5 г желатины и 0,1 г бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды), 2) 10%-ный раствор соляной кислоты, 3) 0,1%-ный раствор нитрита натрия, 4) 8%-ный раствор мочевины и 5) 0,1%-ный раствор N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида.

Точно 0,05 г пара-аминобензойной кислоты с температурой плавления 186—187° отвешивают в стаканчике емкостью 15—20 мл, растворяют в 96%-ном этиловом спирте, переливают в мерную колбу емкостью 50 мл, стаканчик промывают 3—4 раза спиртом (общее количество спирта 25 мл), раствор доводят водой до метки и перемешивают. Из этого раствора отбирают 1 мл в колбу емкостью 250 мл, прибавляют 175 мл воды, 45 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, 2,5 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают. В 1 мл раствора содержится 0,004 мг пара-аминобензойной кислоты.

В четыре колбы емкостью 15—20 мл вливают пипеткой 1, 2, 3 и 4 мл приготовленного раствора и доводят объем раствора в каждой колбе водой до 5 мл и прибавляют по 0,7 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, по 1 мл 0,1%-ного раствора нитрита натрия, хорошо перемешивают и оставляют на 5 минут. Затем в каждую колбу прибавляют по 1 мл 8%-ного раствора мочевины, перемешивают и вновь оставляют на 5 минут. После этого в каждую колбу прибавляют по 1 мл 0,1%-ного раствора N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида, по 1,3 мл воды, перемешивают, оставляют на 10 минут и затем определяют окраски раствора" электрофотоколориметром со светофильтром 550 нм. Для получения стандартной кривой на оси ординат наносят показания гальванометра, а на оси абсцисс — количество миллиграммов и соединяют прямой линией точки пересечения перпендикуляров, восстановленных из соответствующих точек осей графика.

Определение общего количества (связанной и свободной) р-аминобензоилглутаминовой кислоты в препаратах

Точную навеску препарата (0,049—0,050 г) в стаканчике емкостью 15—20 мл смачивают несколькими каплями воды и растворяют в 0,1 н. растворе едкого натра. Раствор переливают в мерную колбу емкостью 50 мл, стаканчик промывают несколько раз 0,1 н. раствором едкого натра, сливая промывную жидкость в ту же колбу. Объем раствора доводят 0,1 н. раствором едкого натра до метки и хорошо перемешивают. Из полученного раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 75 мл воды, 18 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, 1 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают (раствор А).

К 75 мл раствора в конической колбе емкостью 150 мл прибавляют 0,5 г цинковой пыли и оставляют на 15 минут при частом перемешивании. Раствор фильтруют через сухой фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 15—20 мл фильтрата. К 2 мл фильтрата в колбе емкостью 15—20 мл прибавляют 3 мл воды, 0,7 мл 10%-ного раствора соляной кислоты и далее поступают, как указано при получении стандартной кривой.

Определение свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоты

К 2 мл раствора А в колбе емкостью 15—20 мл добавляют 8 мл воды и далее поступают, как описано при определении общего количества пара-аминобензоилглутаминовой кислоты. Содержание фолиевой кислоты в граммах (х) вычисляют по формуле

где а — общее количество свободной и связанной пара-аминобензоилглутаминовой кислоты, найденной по калибровочной кривой, в миллиграммах; b — количество свободной пара-аминобензоилглутаминовой кислоты, найденной по калибровочной кривой, в миллиграммах; 25 и 10 — постоянные коэффициенты; 3,22 — фактор пересчета пара-аминобензоилглутаминовой кислоты на фолиевую кислоту.

Витамин В12(Цианкобаламин)

Качественные реакции

Раствор витамина В12 имеет характерный спектр поглощения в ультрафиолете с максимумами при 278, 361 и 548 нм и коэффициентами поглощения в указанных точках соответственно 115, 207 и 64, причем коэффициент поглощения при 361 нм для препаратов обычной очистки превышает в 2,8—3,4 раза коэффициент поглощения при 548 нм.

Количественное определение

І.Спектрофотометрический метод. В растворах ампулированных препаратов в кювете спектрофотометра (в 1 см толщины) определяют коэффициент поглощения при 548 нм. Содержание витамина В12 в 1 мл испытуемого раствора вычисляют по формуле. Количество витамина В12 в микрограммах где Е — наблюдаемый коэффициент поглощения; 64 — коэффициент поглощения для 1%-ного раствора витамина В12, т. е. при содержании 1000 микрограммов в 1 мл; 104 — коэффициент пересчета концентрации витамина В12 с 1% в микрограммы на 1 мл.

2. Колориметрический метод. При отсутствии спектрофотометра пользуются фотоэлектроколориметром с зеленым светофильтром. Содержание витамина В12 в испытуемом образце определяют путем измерения коэффициента поглощения. По найденному коэффициенту, пользуясь калибровочной кривой, устанавливают какое количество витамина В12 ему соответствует. Для составления калибровочной кривой для колориметра ФЭК берут растворы чистого витамина В12 с содержанием 10, 15, 20, 25 и 30 мкг в 1 мл и определяют коэффициенты поглощения, пользуясь кюветами в 1 см толщиной.