Масс-спектрометрия представляет собой метод исследования веществ, основанный на определении массы и относительного количества ионов, образованных из молекул, подвергнутых ионизации. Приборы, позволяющие получить масс-спектры, называются масс-спектрометрами.

Каждый масс-спектрометр независимо от деталей конструкции состоит из следующих основных элементов:

1) системы введения вещества в прибор;

2) источника ионов, предназначенного для получения ионов из анализируемых веществ;

3) масс-анализатора, предназначенного для разделения ионов2 по массам (вернее, по отношению массы к заряду);

4) детектора и регистрирующего устройства, предназначенного для регистрации количества образующихся ионов различной массы;

5) вакуумной системы, обеспечивающей необходимый вакуум в приборе.

Большие принципиальные возможности масс-спектрометрии появляются при сочетании её с другими методами. Сочетание методов значительно расширяет возможности каждого из них, позволяя получать больше информации об объекте исследования.

Весьма эффективными, как для хроматографии, так и для масс-спектрометрии, оказались хромато-масс-спектрометры – одни из наиболее распространенных современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предварительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измерение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому масс-спектрометры в хромато-масс-спектрометрах большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями, на короткое время поступающими в источник ионов.

Рассмотрим наиболее распространенные масс-спектрометрические методы.

1. Хромат -масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

В индуктивно-связанной плазме ионы генерируются при атмосферном давлении, в то время как масс-спектрометр работает при давлении меньше чем 10-5 мБар. Между ИСП и МС используется интерфейс в виде «узкого горла», с помощью которого вытягиваются ионы из плазмы и осуществляется перепад давлений.

Этот метод позволяет определить элементный состав биоматериала.

Преимуществами этого метода являются:

· Многоэлементность

· Низкие пределы обнаружения

· Малое время анализа

· Малый объем анализируемой пробы

Недостатком является то, что спектральные и матричные влияния существенно повышают нижнюю границу определения содержания.

Метод используется для выявления нарушений микроэлементного статуса пациента путем анализа крови, мочи или волос и позволяет разработать дополнительные пути коррекции различных патологий, а также прогнозировать и предотвращать ряд осложнений.

2. Газовая хроматография-сжигание-масс-спектрометрия

Позволяет определить соотношение изотопов 13С\12С. Метод широко используется в спортивном допинг-контроле. Соотношение этих изотопов в организме человека лежит в пределах от -17‰ до -27‰. При употреблении допинг-препаратов, которые изготавливаются обычно из растительного сырья, соотношение меняется до -30‰.

Перед определением изотопного соотношения хроматографичеки отделяют гормоны и вещества, аналогичные гормонам. Затем проводят определение соотношения изотопов.

Основная проблема этого анализа – сложность матрицы и существенная разница концентраций целевых соединений.

Так как пробоподготовка в масс-спектрометрических методах сложная и многоэтапная, каждая проба сопровождается двумя контрольными: заведомо положительной и заведомо отрицательной.

Иммунохимические методы

В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела – это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в иммунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества – антигена.

Антиген – это вещество, которое индуцирует выработку антител.

Достоинства метода:

· Быстрота и простота определения;

· Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях;

· Не сложная пробоподготовка;

· Высокая точность;

· Не требуется дорогостоящей аппаратуры.

Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы.

Метод применяется для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов, определения биологически активных веществ.

Для определения моновалентных антигенов используется конкурентная схема – в систему водятся меченые ферментом вещества, которые конкурируют с антигеном при взаимодействии с ограниченным числом центров связывания специфичных антител.

Существует два способа реализации иммунохимического анализа – прямой и непрямой.

Прямой способ. Антитела нанесены на твердую фазу, ферментная метка вводится в антиген. Преимущества – небольшое число стадий и, соответственно, возможность автоматизации определения. Недостатки – сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных коньюгатов (промежуточная стадия иммунной реакции), а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента

Непрямой способ. Антиген наносится на твердую фазу, ферментной меткой отмечаются вторичные антитела, полученные против иммуноглобулинов соответствующего типа. Достоиством этого способа является возможность устранения влияний различных эффектов на каталитические свойства ферментов.

На основе иммуннохимического метода создано множество тест-систем. Они реализуются обычно на микропланшетах или в пробирках. С помощью тест-систем определяются гормоны и лекарства в сыворотке крови. Кроме того, на основе иммунной реакции создаются биосенсоры.

Электроаналитические методы в биомедицинских исследованиях

Еще на заре развития электрохимических методов анализа (ЭМА) объекты биологии, медицины и фармации привлекали внимание исследователей. Это прежде всего относится к классической полярографии, в меньшей мере к потенциометрии и вольтамперометрии. В 30-х годах XX века чешский исследователь Брдичка обнаружил каталитические волны белков в аммонийно-аммиачных буферных растворах в присутствии солей кобальта. Впоследствии этот метод был применен в медицине для диагностики рака, а затем и для других заболеваний. Он известен как серологическая реакция Брдички. Достижения классичекой полярографии в биологии, медицине и фармации обобщены в монографии М. Бржезины и П. Зумана, которая оказала самое плодотворное влияние на развитие этой области ЭМА. Большая часть пионерских работ в этой области анализа были выполнены исследователями, которые имели базовое образование фармацевта, что не могло не сказаться на применении этого метода в биомедицинских исследованиях С помощью методов ВА определяли различные метаболиты, белки, идентефицировали ферменты, оцнивали их активность по продуктам ферментативных реакций, исследовали процессы в микроорганизмах, суюклеточных культурах, в тканях по продуктам их жизнедеятельности. Кроме того, эти методы применяли для получения электрохимических характеристик веществ, участвующих в переносе электронов в процессе дыхания и фотосинтеза, при моделировании окислительно восстановительных процессов в живой клетке, а также для исследования структурных особенностей биологических макромолекул и биомембран и т.д. В 60-х годах с появлением ионоселективных электродов (ИСЭ) стало возможным потенциометрическое определение катионов и анионов как in vitro, так и in vivoв растворах, включая цельную кровь.