2.3 Методики исследований

2.3.1 Диагностика вирусных и бактериальных болезней картофеля методом иммуноферментного анализа

Главной задачей при получении достаточного количества оздоровленного материала является проведение исследований на заражённость вирусными и бактериальными болезнями.

Использование иммуноферментного анализа даёт наиболее точный результат. Техника проведения анализа отработана в лаборатории биотехнологии картофеля КемНИИСХа по использованию иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов и бактериозов.

Иммуноферментный анализ протекает поэтапно.

Первый этап. В лунки вносится раствор со специфическим антителом X;Y;A;Rw; вирусом и бактериозом Чн, Кг.

Второй этап. Антитела вирусов X;Y;A;Rw; вирусом и бактериозом Чн, Кг соединяются с ранее закрепившимися антителами, образуется соединение “антитело-антиген”.

Третий этап. Соединение реагирует с антителом АР – коньюгат, при этом образуется, так называемый “сэндвич - варианта”- двойное тело.

Четвёртый этап. Происходит ферментативная реакция окисления ортофенилдиамина кислоты с помощью кислорода, отцепленного от перекиси водорода с образованием продуктов с высоким коэффициентом эксенкции. Ели в тестируемом материале есть вирус, то получается комплекс из “ антитела – вирус – антитела - фермента”. В результате ферментативной реакции с субтратом развивается ярко оранжевая окраска, определяющаяся как инструментально, так и визуально.

В состав набора, рассчитанного на проведение 1000 анализов, входят 10 реагентов: покровный буфер, промывочный буфер, субстратный буфер, ортофенил – недиамин, высокоспецифические антитела, иммунопероксидазный коньюгат, перекись водорода, положительный контроль, бычий сывороточный альбумин, детергент и полистирольные платы.

Покровный буфер А применяется для разведения антител. Содержимое флакона с этикеткой покровного буфера растворяют в 100 мл дистиллированной воды или берут точно навески: Nа – 1,59 г; NаНСО3 – 2,93 г, растворяют в дистиллированной воде, доводят объём до 1000 мл в мерной колбе, замеряют рН, которая должна быть 9,6.

Для промывочного буфера берут точно навески: NаСl -8 г; КН2 РО4 – 0,2 г; NаНРО4 + 12 Н2О – 2,9 г; KCl – 0.2г. Навески объединяют и растворяют в мерной посуде, доводят до объёма 1000 мл, при рН – 7,4. Добавляют 0,5 мл детергента “TWEEN-20”. Раствор готовится в двойном объёме один для промывки, другой для буфера “С”.

Буфер “С” – для проб и коньюгатонтов готовится из буфера “В”. В буфер “В” добавляется бычий сывороточный альбумин из расчёта 1,0г на 250 мл буфера. Размешивается до полного растворения. Раствор “С” используется свежеприготовленным.

Субстратный буфер “Д” состоит из четырёх компонентов, Nа2НРО4,

12Н2О – 9,16г, лимонная кислота, субстрат -4 мл на 100 анализов. Перекись водорода, 3% раствор – 0,5 мл на 10 мл готового субстрата. Положительный контроль. Содержимое флакона с этикеткой “положительный контроль” растворяется в 1 мл буфера “С”. Вносится по 0,1 мл/100 мкл. Для субстрата и субстратного буфера нужна тёмная посуда [14] .

2.3.2 Методика проведения исследований на грибную инфекцию

Учёт грибных болезней в поле проводится по методике апробации картофеля в следующие сроки: первый - в период всходов, когда растения достигают высоты 15-20 см (ризоктониоз); второй – во время бутонизации - массового цветения картофеля (ризоктониоз, фитофтороз, альтернариоз, грибные увядания); третий – за две – три недели до уборки, когда ещё можно отличить здоровую ботву от поражённой, или перед уничтожением ботвы (фитофтороз, ризоктониоз, в том числе грибные увядания).

При практическом учёте болезней растений в производственных условиях в пробе определяют не только вид заболевания, но и степень поражения в соответствии с разработанными шкалами:

Фитофтороз и альтернариоз:

9 баллов. Симптомы поражения отсутствуют;

8 баллов. Поражение может составлять от 1 до 10% поверхности листьев в виде единичных пятен на отдельных растениях;

7 баллов. Поражается от 10-25% поверхности листьев (симптомы могут отличаться почти на всех листьях, но кусты сохраняют нормальную форму);

5 баллов. От 25-50% поверхности листьев растений (поражено каждое растение, но цвет куста остаётся зелёным);

3 балла. Поражается более 50% площади листовой поверхности всех растений (доминирует бурый или зелёный цвет, но стебли остаются зелёными);

1 балл. Все листья растений полностью поражаются, стебли погибают или погибли.

Ризоктониоз (ростки, подземная часть). Степень поражения ростков, подземной части растений ризоктониозом устанавливается по шкале:

9 баллов нет поражения;

7 баллов (0%) пятна единичные, поверхностные, не более 1/4 длины ростка, подземной части стебля;

5 баллов (25-50%) язвы глубокие, охватывающие всю окружность и до 1/ 2 длины ростка, стебля;

3 балла (50%) язвы глубокие, охватывающие всю окружность и более 1/ 2 длины ростка, стебля приводящие к частичному увяданию стебля и поражению листьев;

1 балл (полное поражение растений), загнивание ростка, нижней части стебля, корней, приводящее к полному увяданию и гибели растений.

Парша обыкновенная, ризоктониоз (клубни). Развитие парши обыкновенной и ризоктониоза определяют по 9 – бальной шкале, где 9 баллов – здоровый клубень, а 1 балл – язвы парши занимают более 50% поверхности клубней и склероции ризоктониоза 15 – 25 % [12] .

2.3.3 Методы определения нематод

Способ промывания. Пробу почвы без предварительного просушивания помещают на металлическое или капроновое сито с диаметром ячеек 2-3 мм вставленное в сито с ячейками 0,1-0,2 мм и промывают сильной струёй воды до тех пор, пока вода, вытекающая из-под сита, не станет прозрачной. На верхнем сите задерживаются крупные частицы, а на нижнем цисты и мелкие частицы. Нижнее сито можно просматривать непосредственно под бинокуляром или смывать осадок в чашки Петри, где смотрят на наличие цист [8].

Анализ образцов клубней и других корнеплодов на приставшие к ним цисты проводят с помощью аппаратов-выделителей цист, описанных выше, но при этом пользуются большими приёмными воронками ёмкостью 8-10 л. Воронку снабжают крупноячеистым ситом, вставляют в треногу над сосудом-смесителем и заполняют клубнями. Промывают картофель струёй воды. Весь последующий анализ проводят, как и анализ сметок. При отсутствии указанных аппаратов клубни моют в тазах или ведрах. Смыв фильтруют, после чего цисты отбирают с фильтров [23].

Для коллекционного питомника подбирался участок, типичный по почвенно-климатическим свойствам для данной зоны. Предшественник - занятый сидеральный (донник) пар. Агротехника в опыте - общепринятая для первичного семеноводства по голландской технологии.

Расположение делянок в опыте – рендомизированным методом, повторность – трехкратная.

Посадка производилась в гладкую поверхность почвы четырёхрядными сажалками с маркерами фирмы “ Крамер” с шириной междурядий 75 см х 40 см. Уборку проводили подкапывающей техникой. Стандартами испытания служили районированные сорта картофеля, в группе ранних использовался сорт Белоярский ранний, среднеранний сорт Невский. Коллекционный питомник высаживался по схеме, где стандарты высаживаются парным дантиль – методом: через каждые два испытываемых сорта, высаживается стандарт. Делянки испытания четырёхрядковые, по 20 кустов в ряду, повторность однократная, согласно методическим указаниям по технологии селекционного процесса картофеля.