Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными генами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выделенной из группы неродственных индивидуумов, представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором имеющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из популяций аналогичные исследования проводят в других популяциях.Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому даже при самой высокой вариабильности такого сайта, число гетерозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную маркировку. Следовательно, информационная емкость такого полиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).

Раздел 6. Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.

Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллельные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых микрои минисателлитных последовательностей в геноме человека, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хромосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повторов являются полиморфными, причем в большинстве из них уровень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных последовательностей различают варьирующие по числу тандемные повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а

также некоторые другие классы повторов. Общее число высокополиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на основе тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих однотипную коровую последовательность. Примером может служить VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с успехом используются для идентификации личности методом ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдогена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомологичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В последнее время многочисленные VNTR- последовательности обнаружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с помощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особенно удобны для такого скрининга геномные библиотеки,сконструированные на основе предварительно фракционированных по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисателитными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие результаты были получены также при скринировании космидных библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР (Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour etal., 1990).

Одним из вариантов минисателлитных последовательностей являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причиной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления коротких тандемных повторов используют синтетические олигонуклеотиды, построенные из простых повторов трех или четырех нуклеотидов.

В последнее время для обнаружения различных классов микросателлитных последовательностей и STR-повторов применяют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР (Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для электрофоретического разделения продуктов амплификации используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы настолько полиморфны, что нашли применение в судебной медицине для идентификации личности. Для повышения достоверности результатов с этой целью используют мультиплексные варианты ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновременно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с использованием полимеразной цепной реакции, то есть на минимальном количестве ДНК, является важным методическим преимуществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа которых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.пр Высокая частота коротких тандемных повторов, уникальность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сайтах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной легкостью идентификации аллелей позволяет широко использовать эти повторы для генетического и физического картирования в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сайты получили название STS (sequence tagged sites). В настоящее время в геноме человека уже идентифицировано около 10 000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менделевскому типу наследования STS-сайты нашли широкое применение и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации мутантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисателлитных последовательностей ДНК является характерной особенностью генома человека. Аналогичные последовательности, обнаруженные в геноме приматов, значительно более однородны,что доказывает возможность существенного увеличения вариа-бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволюционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).Сведения о мутабильности высокополиморфных последовательностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано,однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций гипервариабильных микро- и минисателлитных последовательностей ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.На культурах клеток показано стимулирующее влияние минисателлитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбинацию. Так, инсерция синтезированной последовательности,составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния обратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомбинации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об-ращают внимание на достаточно высокую стабильность минисателлитных аллелей, что позволяет их широко использовать как для генетического маркирования, так и для популяционных исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерпринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Иванов,1989).