где Х — число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах, 20 — разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250 —объем одного большого квадрата 1/250.

Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50.

При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда.

Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе) – 45*109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100 лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).

Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:

150 клеток (общее количество - 45*109/л (количество клеток в 1 мкл, лейкоцитов и нормобластов, полученное при подсчете в камере полученное при подсчете или на анализаторе)

лейкоцитарной формулы)

100 клеток (лейкоциты) - Х (истинный лейкоцитоз крови)

Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 * 109/л.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

• Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.

• Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата).

•Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис

лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

•Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

•Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа. (Луговская и др., 2002)

2.3 Методы подсчета количества тромбоцитов.

Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в счет ной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.

Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.

Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови.

Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему. (Луговская и др., 2002)

Метод подсчета в камере.

Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.

Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25-ЗО мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру. Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты считают в 25 больших квадратах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований.

Расчет тромбоцитов проводят по формуле:

,

где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных тромбоцитов умножают на 2000.

Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. (Клиническая лабораторная аналитика, 1999)

Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75 и вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”. Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).

Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови.

Например: А=60‰; число эритроцитов 5 *1012/л

Составляют пропорцию: 60 - 1000

Х - 5*1012/л, откуда

Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0 * 109/л

В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов (фирма «Гем»). (Луговская и др., 2002)

Заключение.

Для подсчета и анализа клеток крови используют ручные микроскопические методы и гематологические счетчики разного уровня автоматизации. В настоящее время необходимо внедрение технологий автоматического изучения клеточного состава крови, для того чтобы добиться высокого качества и точности исследований, исключая ошибки, зависящие от работы лаборантов. Клинические лаборатории нуждаются в разработке новых более совершенных методов.