Введение.

Генная диагностика имеет большое будущее в экспресс – диагностике инфекционных заболеваний. На ранних этапах инфекции, когда АТ в организме ещё не выработаны, диагностика основана на идентификации Аг, в том числе специфических генов возбудителя. Для этого выявления применяют методы гибридизации и амплификации ДНК.

Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее, разработаны тест – системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а так же для идентификации колоний Neisseriagonorrhoeae, Haemophilusinfluenzaeтипа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.

Гибридизация нуклеиновых кислот.

Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот. Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединятся с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (И РНК), меченных изотопами или ферментами. В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

Метод гибридизации в растворах даёт самые быстрые результаты. Широкому внедрению метода препятствует проблема несвязавшихся нитей нуклеиновых кислот.

Метод гибридизации на твёрдой основе и его сэндвич – модификация, распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Несвязавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.

Полимеразная цепная реакция.

Основу метода ПЦР составляет катализируемое ДНК – полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально производят отжиг – термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции применяют синтетические праймеры – олигунуклеотиды, состоящие из 10 – 20 нуклеотидов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в 50 – 1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную tag – полимеразу, что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag – полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует. ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод ПЦР лежит также в основе ДНК – идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр.

Выявление вирусных Аг.

ИФА.

В настоящие время уже появились коммерческие наборы для выявления некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать за 5 – 10 минут. Для выявления Аг на твёрдой фазе собирают известные АТ и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые АТ, специфичные к сорбированым АТ. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК.

Это высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот insitu. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстана – Барр и др.

ПЦР.

Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Медицинская микробиология, под редакцией акад. РАМН В. И. Покровского, Москва ГЭОТАР – МЕД 2001

(стр. 137 – 138, 268 – 271, 276 – 277)