Согласно классификации ВОЗ, различают два основных типа сахарного диабета. Это инсулинзависимый (I тип) и инсулиннезависимый (II тип) сахарный диабет. Инсулинзависимый сахарный диабет, как правило, развивается у лиц молодого возраста и детей, имеющих генетическую предрасположенность к сахарному диабету именно данного типа. Инсулиннезависимым сахарным диабетом чаще болеют лица, старше 50 лет (особенно женщины). Наследственная предрасположенность играет большую роль, чем при сахарном диабете I – типа.

Механизм развития сахарного диабета сложен и многогранен. Он зависит как от функции самой поджелудочной железы, так и от внепанкреатических факторов. Прежде всего, нарушен обмен углеводов. Из-за недостатка инсулина или других причин затрудняется переход глюкозы в мышечную и жировую ткань, снижается синтез гликогена в печени, усиливается образование глюкозы из белков и жиров (глюконеогенез). В развитии этих процессов увеличивается содержание глюкозы в крови. Если в норме оно довольно устойчиво и натощак у здоровых людей колеблется в пределах 3,33 – 35,55 ммоль/л (70 – 100 мг%), то при сахарном диабете в зависимости от формы и тяжести течения обычно превышает 6,00 ммоль/л, достигая 20 –30 ммоль/л и больше.

Диабет у детей и подростков характеризуется тяжелым течением и, как правило, острым началом заболевания. От времени появления первых признаков заболевания (жажда, похудание, выделение большого количества мочи, общая слабость, сухость кожи) до развития тяжёлого состояния и значительных нарушений обмена веществ, проходит обычно 2 недели. Дети, больные сахарным диабетом, требуют обязательного лечения и постоянного лечебного контроля.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нами обследован 41 ребёнок, страдающий инсулинзависимым сахарным диабетом, и 10 человек контрольной группы. Объектом исследования служили эритроциты больных и здоровых детей. Для получения эритроцитов кровь брали из локтевой вены капельным способом, в качестве антикоагулянта использовали гепарин.

Исследования проводили в общей эритроцитарной массе детей, страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом, и детей контрольной группы.

2.1. Подготовка эритроцитов

Свежую гепаринизированную кровь разливали в центрифужные пробирки по 5 мл. После пятнадцатиминутного центрифугирования при 3000 об/мин при 40 С отбирались и отбрасывались лейкоцитарный слой и плазма. Эритроциты суспендировали в десятикратном объёме 0.9% раствора NaCl и центрифугировали в течение пятнадцати минут при 3000 об/мин. Супернатант отсасывали, процедуру повторяли 3 раза. Это делалось для более плотной упаковки эритроцитов.

2.2. Метод раздельного определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах

Для количественных определений АК, ДАК и ДКГК использовали метод J.H. Roe, C.A. Kuether (1943) в модификации В.В. Соколовского, Л.В. Лебедевой, Т.Б. Лиэлуп (1967). Метод основан на взаимодействии 2,4- динитрофенилгидразина с ДАК с образованием в серной кислоте соответствующего озазона. ДАК и ДКГК дают красное окрашивание, используемое для фотометрического определения. Для вычисления суммы всех кислот их окисляют 2,6- дихлорфенолиндофенолятом натрия. Содержание АК определяют по разности. Для дифференцированного определения ДАК и ДКГК смесь подвергают действию восстановителей, при этом в АК восстанавливается только ДАК. В качестве восстановителя использовали димеркаптопропансульфонат натрия (унитиол)

Реактивы:

1. 2.10 М унитиол (0.84 мл 5% раствора ампулированного препарат в 100 мл 0.2 М фосфатного буфера рН 7.0. хранить не более суток).

2. 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ). Хранить в холодильнике не более двух недель.

3. 85% раствор серной кислоты (100 мл воды + 900 мл концентрированной серной кислоты).

4. 2% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 9Н серной кислоте, содержащей 0.25% тиомочевины (хранить в холодильнике не более 1 месяца).

5. 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия (краска Тильманса). Хранить в темноте не более 1 недели.

6. 0.9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор).

Ход определения.

В три пробирки помещали по 0.5 мл упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов с известным гематокритом. В первую прибавляли 0.25 мл физиологического раствора и 0.25 мл унитиола. После пятнадцатиминутной инкубации при периодическом помешивании суспензии отбирали 0.5 мл экстракта, к которому прибавляли 1.5 мл ТХУ.

В две другие пробирки также прибавляли по 1.5 мл ТХУ.

В две пробирки вносили по 0.75 мл супернатанта, полученного при центрифугировании смеси упакованных эритроцитов с ТХУ. В одну из пробирок добавляли по каплям 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия до появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд. В третью пробирку помещали 0.75 мл супернатанта, полученного после центрифугирования смеси упакованных эритроцитов с физиологическим раствором, унитиолом и ТХУ. Во все пробирки добавляли по 0.25 мл 2,4- динитрофенилгидразина и доводили объём до 1.25 мл дистиллированной водой, инкубировали при 100 0 С в течение 10 минут и охлаждали в ледяной бане. В каждую пробирку добавляли небольшими порциями 1.25 мл 85% раствора серной кислоты, охлаждая в ледяной бане после каждой порции. Окрашенные растворы фотометрировали через час при длине волны 540 нм.

Концентрацию кислот определяли по формуле:

С = (3*А)/0.085; где

С – концентрация кислот, мг%

3 – концентрация стандартного раствора, мг%

А – оптическая плотность пробы

0.085 – оптическая плотность стандартного раствора

2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследований обрабатывались статистически (Лакин И.А., 1976).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Целью исследования являлось определение содержания аскорбата и его окисленных форм – ДАК и ДКГК в общей эритроцитарной массе взрослых, страдающих ИЗСД, со стажем болезни более 10 лет; сравнение и сопоставление полученных результатов с данными, полученными ранее, в ходе работы со здоровыми детьми и страдающими ИЗСД. В эксперименте участвовал 21 взрослый в возрасте от 25 до 40 лет, 37 больных детей и группа контроля, включающая 10 здоровых детей. Результаты исследований отображены на диаграммах.

Рис.1. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и детей, страдающих ИЗСД (мг%)

Рис. 2. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых, страдающих ИЗСД (мг%)

Как следует из полученных результатов, в эритроцитах детей и взрослых, страдающих ИЗСД, наблюдается увеличение содержания окисленной форма АК-ДАК, что может свидетельствовать о нарушении процесса восстановления АК в ДАК, большем участии АК в метаболических процессах, нарушении транспорта АК в клетке.