тонкостенных пипеток

Табл.1. Геометрические параметры

кончиков пипеток, изготавливаемых

из различных типов ст. капилляров

Мембранные фрагменты

При работе с некоторыми клетками, например, с изолированными с помощью ферментов клетками миокарда, гигаомные контакты иногда формируются спонтанно, при прикосновении кончиком пипетки к поверхности клетки высокоомный контакт формируется без подсасывания. В этом случае не наблюдается никаких деформаций клеточных мембраны, и площадь мембранного фрагмента можно оценить по значению сопротивления пипетки до образования контакта. Но в большинстве случаев контакт формируется только при небольшом разрежении, создаваемом внутри пипетки. При этом поверхность мембраны деформируется, часть её втягивается внутрь пипетки на 2-3 мкм, принимая Q-образную форму. Когда фрагмент изолируют механическим отведением кончика пипетки от поверхности клетки, его У-образная форма практически не изменяется. При дальнейшем подсасывании образуется сферический пузырёк. Если известна удельная ёмкость мембраны (как правило, она составляет 1 мкф/см2), площадь фрагмента можно оценить по величине его ёмкости; обычно площадь варьирует от 2 до 25 мкм2.

Электронные схемы для пэтч-кламп регистрации

Электронная схема пэтч-кламп регистрации должна иметь такие параметры, чтобы было возможным зарегистрировать передвижение всего лишь нескольких сотен элементарных электрических зарядов через малый участок клеточной мембраны. При максимально сниженных собственных шумах измерительной аппаратуры, токи через одиночные электровозбудимые Са-каналы, можно зарегистрировать только в нефизиологических условиях – например, при использовании растворов, содержащих Ва2+ вместо Са2+.

Стандартным методом измерения малых токов является регистрация создаваемого ими падения напряжения на высокоомном сопротивлении. На рис.3 представлен три электрические цепи, с помощью которых осуществляются подобные измерения. Наиболее удобно автоматическое поддержание требуемого значения Vб с помощью операционного усилителя, который представляет собой управляемый потенциалом источник напряжения ( рис.3, в).

Регистрация от целой клетки в условиях плотного контакта

Несмотря на то, что метод пэтч-кламп был разработан для регистрации токов через одиночные каналы, пэтч-пипетки можно с успехом использовать также для регистрации токов от целой клетки (РЦК), особенно когда размеры её невелики. После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под пипеткой можно разрушить, прикладывая к ней короткие импульсы отрицательного давления. Такая манипуляция в большинстве случаев не нарушает контакта пипетки с мембраной, и в результате между пипеткой и содержимым клетки устанавливается хорошо изолированный от омывающего раствора проводящий путь. Такой способ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений, чем введение стандартного микроэлектрода. Входное сопротивление небольших клеток велико по сравнению с эффективным сопротивлением кончика пипетки, поэтому при работе с ними электрические измерения можно проводить от участка мембраны намного большей площади, чем у исходного фрагмента. В отличие от разных вариантов ПК регистрации этот метод позволяет осуществить регистрацию от мембраны целой клетки, а не от маленького мембранного фрагмента.

Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим раствором с низкой концентрацией ионов кальция. Пипетку прижимают к поверхности клеточной мембраны, в результате чего формируется высокоомный контакт. Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт. На этом этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты, обусловленной ёмкостью держателя и стенок пипетки. К пипетке прикладывают импульсы отрицательного давления до тех пор, пока вновь не появятся ёмкостные переходные процессы (возникает дополнительный ток).

Регистрацию от целой клетки можно проводить в течение часа без визуальных или электрических признаков нарушения мембраны. Если исследуемая клетка плотно прикрепилась к культуральной чашке, плавным отведением её от пипетки можно получить конфигурацию outside-out. После такой процедуры клеточная мембрана быстро “зашивается” и клетка является интактной. Но содержимое клетки соответствует раствору в пипетке. Это используется в различных целях:

1. для изменения содержимого выбранной клетки с минимальным повреждением её мембраны.

2. Для проведения исследований с различными внутриклеточными растворами на одной и той же клетке путем смены регистрирующих пипеток.

3. Для регистрации в одном эксперименте интегральных токов и одиночных каналов.

Пипетки должны быть сравнительно широкими и иметь кончики с большим углом схождения.

Между раствором в пипетке и содержимым клетки происходит быстрый обмен, поэтому раствор для заполнения пипеток должен быть близок по своему составу к клеточному содержимому.

Таб. 2. Типичные электрические параметры,