Размер рибонуклеотидной затравки невелик (менее 20 нуклеотидов) в сравнении с размером цепи ДНК, образуемой ДНК-полимеразой. Выполнившая свою функцию РНК-затравка удаляется специальным ферментом, а образованная при этом брешь заделывается ДНК-полимеразой, использующей в качестве затравки 3'-ОН-конец соседнего фрагмента Оказаки (см ниже). Удаление крайних РНК-праймеров, комплементарных 3'-концам обеих цепей линейной материнской молекулы ДНК, приводит к тому, что дочерние цепи оказываются короче на 10-20 нуклеотидов (у разных видов размер РНК-затравок различен). В этом заключается так называемая "проблема недорепликации концов линейных молекул". В случае репликации кольцевых бактериальных ДНК этой проблемы не существует, так как первые по времени образованиЯ РНК-затравки удаляются ферментом, который одновременно заполняет образующуюся брешь путем наращивания 3'-ОН-конца растущей цепи ДНК, направленной в "хвост" удаляемому праймеру. Проблема недорепликации 3'-концов линейных молекул ДНК решается эукариотическими клетками с помощью специального фермента - теломеразы.

Работа теломеразы

В 1985 году он был обнаружен у равноресничной инфузории Tetrahymena thermophila, а впоследствии - в дрожжах, растениях и животных, в том числе в яичниках человека и иммортализованных(бессмертных) линиях раковых клеток HeLa. Теломераза является ДНК-полимеразой, достраивающей 3'-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими (6-8 нуклеотидов) повторяющимися последовательностями (у позвоночных TTAGGG). Согласно номенклатуре, этот фермент называют ДНК- уклеотидилэкзотрансферазой или теломерной терминальной трансферазой. Помимо белковой части теломераза содержит РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами. Длина теломеразной РНК колеблется от 150 нуклеотидов у простейших до 1400 нуклеотидов у дрожжей, у человека - 450 нуклеотидов. Сам факт наличия в молекуле РНК последовательности, по которой идет матричный синтез куска ДНК, позволяет отнести теломеразу к своеобразной обратной транскриптазе, то есть ферменту, способному вести синтез ДНК по матрице РНК.

В результате того что после каждой репликации дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20 нуклеотидов), образуются выступающие однонитевые 3'-концы материнских цепей. Они-то и узнаются теломеразой, которая последовательно наращивает материнские цепи (у человека на сотни повторов), используя 3'-ОН-концы их в качестве затравок, а РНК, входящую в состав фермента, в качестве матрицы. Образующиеся длинные одноцепочечные концы, в свою очередь, служат матрицами для синтеза дочерних цепей по традиционному репликативному механизму.

Постепенное укорочение ДНК хромосом во время репликации является одной из теорий "старения" клеточных колоний. Еще в 1971 году отечественный ученый А.М. Оловников в своей теории маргинотомии (от лат. marginalis -краевой, tome - сечение) предположил, что это явление лежит в основе ограниченного потенциала удвоения, наблюдаемого у нормальных соматических клеток, растущих в культуре in vitro, так называемого "лимита Хейфлика". Американский ученый Леонард Хейфлик в начале 60-х годов показал, что если для культивирования взять клетки новорожденных детей, то они могут пройти 80-90 делений, в то время как соматические клетки от 70-летних делятся только 20- 30 раз. Ограничение на число клеточных делений и называют лимитом Хейфлика.

Расплетание двойной спирали ДНК

Поскольку синтез ДНК происходит на одноцепочечной матрице, ему должно предшествовать обязательное разделение (хотя бы на время) двух цепей ДНК. Исследования, проведенные в начале 60-х годов на реплицирующихся хромосомах, выявили особую, четко ограниченную область репликации, перемещающуюся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующуюся местным расхождением двух ее цепей. Эта активная область из-за своей Y-образной формы была названа репликационной вилкой. Именно в ней ДНК-полимеразы синтезируют дочерние молекулы ДНК. С помощью электронной микроскопии реплицирующейся ДНК удалосьустановить, что область, которая уже реплицирована, имеет вид глазка внутри нереплицировавшейся ДНК. Важно отметить, что репликационный глазок образуется только в тех местах молекулы, где находятся специфические нуклеотидные последовательности. Эти последовательности, получившие название точек начала репликации, состоят приблизительно из 300 нуклеотидов. В зависимости от того, в одном или в двух направлениях происходит репликация (а это зависит от природы организма), глазок содержит одну или две репликационные вилки. Последовательное движение репликационной вилки приводит к расширению глазка.

Двойная спираль ДНК весьма стабильна; для того чтобы она раскрылась, необходимы особые белки. Специальные ферменты ДНК-хеликазы быстро движутся по одиночной цепи ДНК, используя для перемещения энергию гидролиза ATФ. Встречая на пути участок двойной спирали, они разрывают водородные связи между основаниями, разделяют цепи и продвигают репликационную вилку. Вслед за этим с одиночными цепями ДНК связываются специальные дестабилизирующие спираль белки, которые не позволяют одиночным цепям ДНК сомкнуться. При этом они не закрывают оснований ДНК, оставляя их доступными для спаривания.

Не следует забывать, что комплементарные цепи ДНК закручены друг вокруг друга в спираль. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперед, вся еще не удвоенная часть ДНК должна была бы очень быстро вращаться. Эта топологическая проблема решается путем образования в спирали своего рода "шарниров", позволяющих цепям ДНК раскрутиться. Принадлежащие к особому классу белки, называемые ДНК-топоизомеразами, вносят в цепь ДНК одноили двухцепочечные разрывы, позволяющие цепям ДНК разделиться, а затем заделывают эти разрывы. Топоизомеразы участвуют также в расцеплении зацепленных двухцепочечных колец, образующихся при репликации кольцевых двунитевых ДНК. С помощью этих важных ферментов двойная спираль ДНК в клетке может принимать "недокрученную" форму с меньшим числом витков; в такой ДНК легче происходит расхождение двух цепей ДНК в репликационной вилке.

Прерывистый синтез ДНК

Легко вообразить, что репликация происходит путем непрерывного роста нуклеотида за нуклеотидом обеих новых цепей по мере перемещения репликационной вилки; при этом, поскольку две цепи в спирали ДНК антипараллельны, одна из дочерних цепей должна была бы расти в направлении 5'-3', а другая в направлении 3'-5'. В действительности, однако, оказалось, что дочерние цепи растут только в направлении 5'-3', то есть всегда удлиняется 3'-конец затравки, а матрица считывается ДНК-полимеразой в направлении 3'-5'. Это утверждение на первый взгляд кажется несовместимым с движением репликационной вилки в одном направлении, сопровождающемся одновременным считыванием двух антипараллельных нитей. Разгадка секрета заключается в том, что синтез ДНК происходит непрерывно только на одной из матричной цепей. На второй матричной цепи ДНК синтезируется сравнительно короткими фрагментами (длиной от 100до 1000 нуклеотидов, в зависимости от вида), названными по имени обнаружившего их ученого фрагментами Оказаки). Вновь образованная цепь, которая синтезируется непрерывно, называется ведущей, а другая, собираемая из фрагментов Оказаки, отстающей. Синтез каждого из этих фрагментов начинается с РНК-затравки. Через некоторое время РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой и фрагменты сшиваются в одну непрерывную цепь ДНК специальным ферментом.