Оглавление

Вопрос 1

Вопрос 2

Вопрос 3

Список использованной литературы

Вопрос 1

Методы изучения клетки: микроспектромериз, цитофотометрия, флуоресцентная и ультрафиолетовая микроскопия. Метод чисторадиографии

Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние влияют на контрастность изображения.

Микроспектромериз

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.

В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате Абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего На него света, что и обусловливает появление изображения.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд.

Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора.

В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля и его разновидности

Метод тёмного поля в проходящем свете используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты.

Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив.

В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света.

Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать») чрезвычайно мелкие частицы.

С помощью иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 2*10-9 м. Но форму и точные размеры таких частиц с помощью этого метода определить невозможно. Непрозрачные препараты (например, шлифы металлов), наблюдаемые по методу тёмного поля в отражённом свете освещают сверху — через специальную кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и называемую эпиконденсором.

Цитофотометрия

Цитофотометрия - является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением цитометрии.

Принцип метода. Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку.

Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

1. рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

2. рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а так же о неоднородности и гранулярности клеток).

3. интенсивность флуоресценции по 4-ем каналам флуоресцентности (позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.)

Наиболее часто используемые флуорохромы

– флуоресцеина изотиоцианат (FITC)

– Фикоэритрин (PE, RD1)

– Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)

– Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

– Фикоэритрин - Техасский красный (ECD)

– Фикоэритрин - Cy5 (PC5)

– Фикоэритрин - Cy7 (PC7)

Преимущества метода

– короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости

– анализ большого количества клеток (до 107 клеток)

– логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток

– измерение параметров редко встречающихся клеток

– объективное измерение интенсивности флуоресценции

Область применения в цитологии:

1. определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток

2. оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов

3. определение экспрессии поверхностных антигенов

4. анализ стадий клеточного цикла

5. измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия - высокочувствительный микроскопический метод (анализ проводится как в отраженном, так и в проходящем свете), основанный на обработке тестируемого материала красителями-флуорохромами. Флуоресцирующие (окрашенные) зоны выглядят при флуоресцентной микроскопии как яркие участки на темном фоне.

Основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса).

При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра.