Примерно к 1970 г. стали известны основные свойства генетических систем. Несмотря на отсутствие многих важных деталей, удалось установить принципы репликации, рекомбинации и репарации и каждый из этих процессов был воспроизведен in vitro. Была сформулирована центральная догма, согласно которой генетическая информация передается от ДНК к РНК и далее к белку, что создало основу для определения генотипа и фенотипа организма на молекулярном уровне. Был идентифицирован основной посредник при переносе информации от ДНК к белку–информационная РНК. Расшифрован генетический код, и в экспериментах с реконструированными клеточными компонентами в системе in vitro была получена информация о клеточном аппарате и основных механизмах трансляции м-РНК в белок. Подтвердилось предположение о том, что процессы транскрипции ДНК в РНК и трансляции РНК в белок регулируются и что существуют позитивный и негативный способы контроля функций генов. С расшифровкой генетического кода разрешился имеющий долгую историю вопрос о связи между химической структурой гена и кодируемого им белка и стало ясно, что мутации есть следствие изменений в структуре ДНК. В этот период выдающихся открытий неожиданной наградой исследователям стала идентификация многих ферментов, для которых нуклеиновые кислоты являются субстратом. Получение их в очищенном виде и определение свойств в значительной мере облегчило анализ структуры и функций нуклеиновых кислот, а применение в дальнейших исследованиях привело к созданию новой области молекулярной биологии – технологии рекомбинантных ДНК.

Несмотря на широко распространенное мнение, что всем генетическим системам присущи одни и те же основные свойства, процессы, происходящие в клетках прокариот, изучены значительно глубже, чем процессы, протекающие в эукариотических организмах. Действительно, провести генетический анализ небольших по размеру и менее сложно организованных бактериальных геномов значительно проще, чем геномов эукариот. Сравнительно легко удалось индуцировать и идентифицировать мутационные изменения в специфических генах. Случайный обмен генетической информацией между различными бактериями и некоторыми бактериями и их вирусами облегчил картирование этих генов, что в свою очередь позволило установить организацию бактериальных и фаговых геномов в целом. Еще более важное значение имело замечательное взаимопроникновение генетики и биохимии. Совместное использование генетических и биохимических методов способствовало разгадке сложного процесса репликации ДНК и даже позволило осуществить полноценную репликацию in vitro вирусных геномов. Благодаря объединению этих методов удалось получить отдельные гены в изолированном виде, что подготовило почву для изучения транскрипции и трансляции генов in vitro и идентификации молекулярных продуктов, участвующих в этих процессах. С помощью того же двустороннего подхода был установлен механизм регуляции экспрессии генов: было показано, что контроль осуществляется главным образом путем взаимодействия между специфичными белками и соответствующими регуляторными последовательностями в ДНК или информационной РНК.

В то же время успехи в расшифровке молекулярной структуры, организации и функций эукариотического генома были весьма скромными. Сложные генетические карты локусов, содержащих мутации, удалось составить лишь для тех немногих эукариотических организмов, с чьими генетическими системами можно было проводить манипуляции. По сравнению с ними генетические карты млекопитающих, в частности мыши и человека, представлялись сплошными «белыми пятнами». Еще более загадочными были молекулярная структура эукариотических генов и их организация в хромосомных ДНК, в частности наличие множественных повторов некоторых сегментов ДНК у большинства эукариот. Без более полного изучения молекулярной структуры геномов эукариот дальнейший прогресс в этой области был невозможен.

Биохимические исследования экспрессии и регуляции эукариотических генов также зашли в тупик из-за отсутствия информации о структуре клеточных генов. Было ясно, что ядерная ДНК эукариот транскрибируется в РНК и что мРНК транслируется в белки с помощью цитоплазматических комплексов рибосома–тРНК, во многом напоминающих прокариотические. Однако механизм транскрипции и последующая судьба транскриптов оставались совершенно загадочными. У многих эукариот только небольшая фракция ядерной РНК переходит в цитоплазму в виде информационной, рибосомной и транспортной РНК. Некоторые молекулы существуют в стабильной форме в виде коротких цепей РНК в составе рибонуклеопротеи-новых частиц, однако большинство из них быстро деградирует, не покидая ядра. Вопросы о природе быстро распадающейся РНК, ее происхождении и функции постоянно дебатировались. Проблема биогенеза информационной РНК также оставалась нерешенной из-за различий между мРНК про- и эукариот. У последних в начале и в конце молекул имеются особые структуры–так называемые кэпы и ро1у-хвосты соответственно. Это указывало на то, что информационная РНК эукариот в процессе биогенеза подвергается посттранскрипционным модификациям. Почему, где и как происходят такие модификации? Каково их значение? Каков путь превращения первичных транскриптов ДНК в зрелые молекулы информационной РНК? Далее, как осуществляется контроль транскрипции и превращений РНК, образованных на разных генах, в разных типах клеток одного и того же организма? Чем различаются механизмы экспрессии и регуляции генов у про- и эукариот? Из-за отсутствия молекулярно-генетической информации и методологии для ее получения эти вопросы первостепенной важности оставались нерешенными.

На фоне появления все новых данных об организации и экспрессии генетической информации у прокариот отсутствие таких данных для эукариот становилось все более ощутимым. Для преодоления такого отставания нужна была общая методология исследования клеточных геномов эукариот на молекулярном уровне. В идеале это позволило бы выделить дискретные гены и определить их молекулярную структуру и организацию геномов. При наличии таких изолированных генетических элементов можно было бы затем установить биохимические основы механизмов транскрипции и трансляции. Объективные предпосылки к этому появились лишь в первой половине 70-х годов, когда была разработана технология получения рекомбинантных молекул ДНК. Прежде чем обсуждать эти достижения, мы рассмотрим концепции и методологию, которые подготовили почву для решающих экспериментов. Они ведут начало от экспериментов в сфере бактериальной генетики, и особенно большую роль здесь сыграла возможность введения молекул ДНК в клетки бактерий. Такая введенная ДНК независимо от того, произошла ли она из бактериофага или из других бактериальных клеток, изменяет генотип, а нередко и фенотип реципиентной клетки. Гены донорной ДНК способны экспрессироваться и могут рекомбинировать с хромосомной ДНК.

Введение новой генетической информации в клетки бактерий

Бактерии могут приобретать новый генетический материал несколькими способами. Это: 1) трансформация, при которой в клетки проникают молекулы ДНК, добавленные в культуральную среду;