Неожиданным было то, что аминокислотная последовательность полученного белка оказалось намного короче таковой у потенциал-активируемого натриевого или кальциевого канала. Пептид калиевого канала содержалтолько один домен, подобный IV домену натриевого канала угря. Экспериментальные данные указывают на то, что в мембране отдельные субъединицы калиевого канала объединяются, формируя мультимерные ионные каналы46). У Drosophila были клонированы четыре отдельных подсемейства калиевых каналов (названные Shaker, Shab, Shaw, Shal). У млекопитающих найдены аналоги для всех этих типов, Shaker2 и т.д.). Изоформы одного и того же подсемейства после экспрессии способны формировать гетеромультимерные каналы, тогда как изоформы, принадлежащие разным подсемействам, такой способностью не обладают.

Подобно натриевому и кальциевому каналам, потенциал-активируемые калиевые каналы обычно экспрессируются вместе с дополнительными субъединицами.

Сколько субъединиц в калиевом канале?

Сравнение структуры калиевого канала со строением родственных натриевого и кальциевого каналов позволило высказать предположение, что полноценный калиевый канал представлен ансамблем четырех субъединиц (тетрамером). Для изучения этого вопроса были проведены эффектные эксперименты с блокатором калиевого канала charybdotoxin (СГХ) в сочетании с использованием мутантов, резистентных к данному токсину. Субъединицы нативного и мутантного типов калиевого канала Drosophila были экспрессированы в ооцит в разных пропорциях. При использовании только нативных субъединиц калиевого канала, формирующих гомомультимерные каналы, калиевые токи в мембране ооцита полностью блокировались высокими концентрациями СТХ. Мутантные каналы при этом практически не блокировалисьТоки в ооцитах, инъецированных как мутантной, так и нативной мРНК, блокировались лишь частично.

Для трактовки этих экспериментов ключевое значение имел тот факт, что связывание СТХ даже одной субъединицей канала уже достаточно для блокирования всего канального комплекса и прекращения тока. Следовательно, в ооцитах, инъецированных смесью нативного и мутантного типов, незатронутыми токсином останутся только гомомультимерные каналы, образованные исключительно мутантными субъединицами. Фракция таких каналов, сформированных случайной ассоциацией субъединиц нативного и мутантного типов, может быть подсчитана по соотношению количества инъецированной мРНК для мутантного и нативного типов канала. Например, если канал состоит из четырех субъединиц и 90% РНК является мутантной, то вероятность формирования каналов, состоящих только из мутантных субъединиц, составит ([0,9]), или 66%. Оставшиеся 34% каналов будут иметь по меньшей мере одну субъединицу нативного типа и будут подвержены блокирующему действию токсина. Аналогичный подсчет предсказывает, что блокирующий эффект СТХ должен составить 27% для каналов-тримеров (каналов, состоящих из 3 субъединиц) и 41% для пентамеров (5 субъединиц). Поскольку в указанных экспериментах наблюдалось блокирование каналов на 34%, удивительно совпадающее с предсказанием, было сделано заключение о тетрамерной структуре калиевых каналов.

Строение поры потенциал-активируемых каналов

Общим признаком аминокислотных последовательностей всех потенциал-активируемых каналов является умеренно гидрофобный участок во внеклеточной петле между S5 и S6 сегментами Так же как в экспериментах, описанных ранее для М2 участка АХР, мутации в этом участке калиевого канала Shaker снижали сродство канала для блокирующего действия тетраэтиламмония (TEA) и изменяли проводимость канала. Было сделано заключение, что этот участок погружен вглубь канала и принимает участие в формирования ионной поры). Этот вывод подтверждался также данными рентгеновской дифракции канала. Петля S5-S6 формирует короткую спираль, которая погружена в центр канала; аминокислоты, восходящие от нижнего конца спирали, образуют верхнюю часть ионной поры. Мутации в области поры существенно затрагивают ионную избирательность потенциал-активируемых ионных каналов. Например, в натриевых каналах мозга крысы замена в области поры в третьем домене положительно заряженного глутамата на отрицательно заряженный лизин приводит к появлению характеристик, свойственных кальциевым каналам. Вместо селективной проницаемости для натрия мутантный канал имеет низкую избирательность для моновалентных катионов. Кроме того, при физиологических концентрациях ионов, большая часть тока через такой канал обеспечивается кальцием.

Анализ структуры калиевого канала с высоким разрешением

Структура калиевых каналов Streptomyces lividans (KCSA каналы) была изучена рентгеновской кристаллографией с разрешением 3,2А). Бактериальные каналы относятся к классу калиевых каналов, субъединицы которых вместо шести трансмембранных доменов имеют только два. Другим примером такого двухдоменного белка является калиевый канал внутреннего выпрямления, который будет обсуждаться позже. Два сегмента калиевого канала являются структурными эквивалентами сегментов S5 и S6 в потенциал-активируемых каналах. Несмотря на разное число трансмембранных сегментов, аминокислотная последовательность в пору-формирующей петле S5-S6 удивительно консервативна у всех калиевых каналов). Преимуществом исследования бактериального калиевого канала является то, что он может быть продуцирован в больших количествах, достаточных для кристаллизации, что делает возможным проведение рентгеновской дифракции.

KCSA канал является тетрамером представляет канал в разрезе и показывает большую часть его структурных деталей. Рядом с NH2-концом каждой субъединицы имеется наружная спираль, которая пронизывает мембрану от цитоплазматической стороны до наружной поверхности. За наружной спиралью следует короткая спираль, направленная в пору. Затем располагается внутренняя спираль, которая возвращается к цитоплазматической стороне. Соединяющие петли между наружной и короткой спиралями образуют четыре возвышения, окружающие наружное отверстие поры и содержащие связывающие сайты для TEA и других блокирующих канал токсинов В каждой субъединице петля между центральным концом короткой спирали и внутренней спиралью формирует структуру ионной поры. Четыре такие петли, объединяясь, образуют узкий проход, ответственный за ионную избирательность канала – селективный фильтр. Относительно большая центральная полость и нижняя внутренняя пора соединяют селективный фильтр с цитоплазмой.

Избирательность для калия достигается как размером, так и молекулярным строением селективного фильтра. Диаметр фильтра составляет около 0,3 нм и аминокислоты в его стенке ориентированы таким образом, что последовательные кольца, образованные четырьмя карбоксильными группами (по одной от каждой субъединицы), обращены внутрь поры. Диаметр поры достаточен для прохождения дегидратированного иона калия (диаметром около 0,27 нм). Следует заметить, что дегидратация проникающего иона могла бы потребовать значительной энергии. Однако этот фактор минимизируется за счет кислорода стенки канала, который заменяет атомы кислорода воды в гидратированной молекуле. Ионы меньшего размера, такие как натрий (диаметр 0,19 нм) или литий (диаметр 0,12 нм), не способны проникнуть через калиевый канал, поскольку они не могут сформировать достаточно плотный контакт одновременно со всеми четырьмя кислородами, поэтому они остаются гидратированными. Ионы большего размера, такие как цезий (диаметр 0,33 нм), не могут проникнуть через пору из–за своих размеров. Эти структурные основы ионной избирательности вполне согласуются с традиционными воззрениями на ионную проницаемость каналов.