7. Альтернативный процессинг пре-мРНК в мозге

Альтернативный процессинг заключается в образовании различных зрелых мРНК из одного первичного транскрипта в результате соединения различных комбинаций экзонов и/или использования различных сигналов полиаденилирования. Одним из наиболее хорошо изученных случаев использования альтернативного сплайсинга для образования различных продуктов в разных клетках является система синтеза регуляторных пептидов, кодируемых геном кальцитонина. Этот ген кодирует небольшое семейство пептидов, два из которых (кальцитонин и катакальцин) преимущественно образуются в клетках щитовидной железы, а третий - в клетках нервной системы.

Исследование структуры гена кальцитонина и зрелых мРНК, кодирующих эти пептиды у крысы и человека, показало, что I-III экзоны являются общими для этих мРНК. IV экзон, кодирующий кальцитонин и катакальцин, присутствует только в мРНК кальцитонина и содержит специфический для нее сигнал полиаденилирования, а V и VI экзоны, содержащие CGRP-кодирующую и 3'-некодирующую последовательности, включая специфический для CGRP-мРНК сигнал полиаденилирования, присутствуют только в CGRP-мРНК. Механизмы выбора различных путей сплайсинга первичного транскрипта CT/CGRP-гена в клетках щитовидной железы и нейрона пока еще остаются неясными и сейчас интенсивно изучаются.

Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов обеспечивает также разнообразие белков миелина в ЦНС млекопитающих. В частности, показано, что различные основные белки миелина у мыши кодируются одним геном shi-локуса: при этом белок 21,5 кД кодируется мРНК, содержащей последовательность всех 7 экзонов гена, белок 18,5 кД - всех, кроме II экзона, белок 17 кД - всех, кроме VI экзона, а белок 14 кД - всех, кроме II и VI экзонов. При этом образующиеся белки идентичны по аминокислотным последовательностям, кодируемым общими экзонами.

Еще одним примером служит так называемый РРТ ген крысы, который кодирует препротахикинины а - и р-типов - предшественники целого семейства нейропептидов - тахикининов. Первый из них содержит последовательность вещества Р, а второй - вещества Р и вещества К. Анализ первичной структуры показал, что эти РНК образуются в результате альтернативного сплайсинга по экзонам, кодирующим вещество К.

Разнообразие потенциал-зависимых и лиганд-зависимых ионных каналов в мембранах нервных клеток обеспечивается существованием кодирующих такие каналы мультигенных семейств и опять-таки альтернативным сплайсингом - Один и тот же ген у дрозофилы кодирует четыре полипептидные цепи, участвующие в формировании функционально активного К-канала. Эти полипептиды имеют одинаковые центральные домены, содержащие характерные для потенциал-зависимых каналов элементы.

Как и в описанных выше системах, разные полипептидные цепи К-канала возникают в результате альтернативного сплайсинга одного первичного транскрипта. Для формирования функционально активного К-канала необходима ассоциация четырех одинаковых или разных полипептидов: очевидно, что комбинирование различных полипептидов может обеспечить широкое разнообразие различающихся по физиологически значимым параметрам каналов.

Еще один яркий пример использования альтернативного сплайсинга - образование семейства синаптических рецепторов глутаминовой кислоты. Каждый из четырех рецепторов этого семейства существует в двух вариантах, различающихся лишь коротким сегментом, предшествующим четвертому трансмембранному домену. Согласно существующей топологической модели рецептора этот сегмент имеет цитоплазматическую локализацию. В генах каждого из рецепторов альтернативные варианты 38-ами-нокислотного сегмента кодируются двумя соседними экзонами, а сами варианты рецепторов образуются в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК по этим экзонам. Добавим, что существование альтернативных вариантов для каждого из рецепторов функционально значимо: они имеют различные фармакологические и кинетические свойства и по-разному распределены в отделах ЦНС.

Наконец, роль альтернативного сплайсинга показана при образовании четырех форм тирозингидроксилазы у человека, трех форм ацетилхолинэстеразы в электрическом органе ската, трех форм периферию у мыши, полипептидов у аплизии, специфических для нейрона R15, и в ряде других случаев.

Очевидно, альтернативный сплайсинг является эволюционно древним и широко распространенным в клетках нервной системы способом увеличения качественного разнообразия синтезируемых в них полипептидов.

8. Экспрессия генома и онтогенез мозга животных

Выше уже отмечено, что общее число транскрибируемых в мозге генов в 1,5-2 раза выше, чем во всех остальных тканях, и составляет, по-видимому, несколько десятков тысяч. Многообразие экспрессируемых в целом мозге генов объясняется двумя причинами:

1) разнообразием таковых в каждом индивидуальном нейроне и 2) различиями в наборах генов, экспрессируемых в разных нейронах. Именно налагаясь друг на друга, эти два фактора являются причиной исключительного разнообразия образующихся мРНК и соответствующих белков. Следует подчеркнуть, что разнообразие синтезируемых в любой ткани последовательностей РНК связано преимущественно с относительно редко встречающимися молекулами, которые составляют небольшую долю от общей массы РНК. К мозгу это приложимо в большей мере, чем к любому другому органу или ткани. Поэтому измерения суммарного синтеза РНК и ее общего количества практически не позволяют судить о качественных характеристиках транскрипции генома.

Транскрибируемость уникальных последовательностей ДНК в мозге млекопитающих прогрессивно возрастает в позднем эмбриогенезе и раннем постнатальном онтогенезе, достигая максимума к моменту функционального созревания. Обнаружено, что транскрибируемость генома в различных отделах мозга человека неодинакова: в гностических областях коры больших полушарий она выше, чем в проекционных, в лобной коре левого полушария значительно выше, чем правого, в мозжечке и стволовых отделах мозга уровень транскрипции - промежуточный. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что развитие сложных гностических функций в мозге человека связано с прогрессивным увеличением генетического разнообразия составляющих его клеточных элементов.

В последние годы появились работы, позволяющие сделать прямые оценки степени генетической специализации клеток мозга. Они основаны на исследовании локализации различных мозгоспецифических антигенов с помощью моноклональных антител и локализации индивидуальных мРНК с помощью комплементарных клонированных последовательностей. Главным недостатком этих методов является их низкая представительность: в каждой работе исследуется ничтожная доля от всех синтезируемых в клетках мозга мРНК и белков. Добавим также, что в сфере этих исследований в большинстве случаев оказываются белки и мРНК, присутствующие в мозге в относительно высокой концентрации и уже в силу этого обстоятельства экспрессируемые в обширных популяциях нервных клеток. Так, обнаружены антигены, специфические для основных типов нервных клеток, а также для нейронов определенных отделов мозга. В рамках соответствующих отделов антигены могут иметь еще более выраженную клеточную специфичность. Известны антигены, которые экспрессируются в перекрывающихся популяциях нейронов в одних отделах ЦНС и неперекрывающихся популяциях - в других. Аналогичные, хотя пока и не столь многочисленные данные получены при исследовании локализации мозгоспецифических мРНК гибридизацией in situ. Судя по морфологическим, нейрофизиологическим, нейрохимическим и другим критериям, в мозге млекопитающих минимальными единицами такой специализации являются группы из десятков-сотен клеток, число которых в мозге крысы - 7104, а в мозге человека - 5-107, Это заведомо превышает общее число экспрессируемых в них генов. По-видимому, морфофункциональная специфичность клеток в мозге определяется уникальностью всей комбинации экспрессируемых в них генов и положением этих клеток в специфических нейронных ансамблях. В то же время тот факт, что такие группы насчитывают десятки-сотни клеток с одинаково экспрессируемым геномом, может объясняться необходимостью повышения надежности работы всей системы в целом. Однако в ЦНС некоторых беспозвоночных такая специализация распространяется на индивидуальные нейроны.