Эту операцию мы уже, по существу говоря, проделывали, когда рассматривали возможность встраивания фрагментов чужеродной ДНК, длиною в тысячи нуклеотидов, в плазмиды. Полная последовательность нуклеотидов для множества плазмид (находящихся в продаже) хорошо известна. Таким образом мы можем естественным образом связать начало (и конец) секвенируемого фрагмента ДНК с известной последовательностью нуклеотидов плазмиды.

Встает вопрос: как узнать точно в какое место плазмиды включился наш фрагмент и как его потом «вырезать» обратно вместе с известным, ему предшествующим куском плазмиды — достаточным по своим размерам для посадки на него надежного праймера? Для ответа на этот вопрос следует вспомнить о существовании (и доступности на рынке) плазмид с «поликлоновым сайтом», насчитывающим несколько десятков пар оснований, искусственно синтезированном так, чтобы содержать в себе «сайты узнавания» для многих рестриктаз.

Для решения нашей задачи надо подобрать две рестриктазы, сайты узнавания которых в пределах поликлонового сайта отстояли бы друг от друга достаточно далеко, на расстояние, большее, чем длина будущего праймера секвенирования. Одна рестриктаза, сайт узнавания которой находился бы в «конце» поликлонового сайта (если мы определились с направлением будущего секвенирования), должна послужить для встраивания подлежащего секвенированию фрагмента ДНК. Вторая — для его последующего вырезания из плазмиды вместе с участком поликлонового сайта разделявшим сайты узнавания обеих рестриктаз. Вся последовательность нуклеотидов на этом участке известна и потому синтезировать комплементарный к нему праймер не представит труда.

Последующее секвенирование таким образом удлиненного фрагмента нашей ДНК либо начнется с его первого нуклеотида, либо с нескольких предшествующих нуклеотидов, относящихся к копированию присоединенного участка поликлонового сайта. Эти нуклеотиды легко узнать и отделить от последовательности самого исследуемого фрагмента ДНК.

Естественно, что ввиду такой определенности ситуации, фирмы-поставщики плазмид с поликлоновыми сайтами предлагают и готовые праймеры (обычно 18-членные), которые они вправе называть «универсальными», ибо они пригодны для секвенирования любых фрагментов ДНК, таким образом подготовленных.

В последнее время для умножения количества секвенируемой ДНК клонированием и создания места посадки праймера стали широко использовать бактериофаг М13. Это — нитевидный фаг, содержащий однонитевую, полностью расшифрованную ДНК. В нее, с помощью рестриктаз, точно так же, как в плазмиду можно встроить чужеродную ДНК. Попадая в клетку E.coli этот фаг приобретает двунитевую структуру и таким образом размножается в клетке («репликативная форма») до более чем 100 копий. Во время деления клетки продолжает размножаться и фаговая ДНК. Но одновременно с этим клетка E.coli (не погибая!) выбрасывает в питательную среду готовые фаговые частицы опять в виде однонитевой ДНК, одетой белком. После удаления E.coli центрифугированием, свободные фаги обрабатывают фенолом и получают однонитевую ДНК фага вместе с изначально встроенным в нее фрагментом чужеродной ДНК. Разобравшись таким образом с проблемой праймера, займемся другими важными практическими аспектами секвенирования ДНК.

Во-первых отметим, что в процессе секвенирования матричная ДНК должна все время оставаться строго однонитевой, без возможных «шпилек» — локальных двунитевых участков, образующихся в силу наличия в этой ДНК близко расположенных, пусть небольших, но комплементарных последовательностей. То же самое относится и к меченым отрезкам ДНК в процессе их разделения электрофорезом. Как мы увидим ниже, в процессе комплементарного синтеза по методу Сэнджера (он повторяется многократно — в несколько циклов) такая опасность не возникает, так как в каждом цикле имеется стадия предварительной полной денатурации при температуре 96°С, а само копирование осуществляется при температуре 60°С. Но электрофорез приходится проводить в сильно денатурирующей среде: 80% -ном растворе формамида, содержащим 5 mM раствор ЭДТА Во-вторых, следует озаботиться тем, чтобы при электрофорезе количество флюоресцентно меченого материала в каждой полосе (даже такой, в которой содержится наименьшее число отрезков ДНК) было достаточным для надежной регистрации. Вместе с тем, этого желательно добиться без чрезмерного расходования исходного материала ДНК, который обычно дефицитен.

Поэтому реакцию ограниченного (включением дидезоксирибонуклеотида) матричного синтеза на том реальном количестве секвенируемой ДНК, которое направляется в эксперимент, повторяют многократно. Это делается точно так же, как в рассмотренной ранее симметричной ПЦР-реакции. Но с тем отличием, что используется только один, начальный праймер («асимметричная ПЦР-реакция»). Этап элонгации заканчивается по достижении конца матрицы (если он не был остановлен раньше). Комплементарный синтез от второго праймера в обратном направлении здесь не фигурирует.

Подобно тому, как это описано в главе 6, здесь готовят 20 мкл инкубационной смеси, в которой содержится: одно или двуните-вая нить ДНК секвенируемого фрагмента (в последнем случае будет копироваться только одна из нитей — та, для которой синтезирован праймер), избыточное количество 4-х нормальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ограниченное количество 4-х флюоресцентных дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, термостабильная Taq ДНК-полимераза и в достаточном количестве синтетический праймер (все это в буфере с MgClg). Инкубационная смесь прогревается предварительно в тонкостенной полипропиленовой пробирочке емкостью в 0,2 или 0,5 мл при 96 °С для полной денатурации ДНК. Затем ее помещают во встроенный в прибор термоблок, где автоматически осуществляется 25 последовательных циклов, каждый из которых состоит из следующих, очень быстро сменяющих друг друга термических экспозиций:

— 10 секунд при 96 °С,

— 5 секунд при 50 °С,

— 4 минуты при 60°С.

Экспозиция при 96°С освобождает однонитевые матричные молекулы секвенируемой ДНК от новосинтезированных укороченных копий своей последовательности вместе с праймерами и Taq ДНК-полимеразой.

При 50 °С новые молекулы праймера гибридизуются с начальными участками освободившихся матриц. Вслед за ними на эти матрицы садятся и молекулы Taq ДНК-полимеразы.

В течение 4-х минут они ведут комплементарный синтез ДНК вплоть до момента случайного включения флюоресцентно меченого дидезоксирибонуклеотида.

Количество копий при таком однонаправленном синтезе не увеличивается многократно, как при симметричной ПЦР-реакции с двумя праймерами, а возрастает в лучшем случае всего в 25 раз — по числу циклов. Однако и этого оказывается достаточно для того, чтобы ограничить количество исходно вносимой ДНК 0,2 или 0,5 микрограммами (соответственно для однонитевой или двунитевой молекулы). В интересах реальной ориентировки, не мешает заметить, что для фрагмента двунитевой ДНК длиной в 1000 пар нуклеотидов в 0,5 мкг содержится более 1011 копий этого фрагмента. В каждом из циклов ПЦР-реакции все они снова и снова выступают в качестве матриц для случайным образом укороченных копирований. Это обеспечивает в конце концов достаточное число одинаковых по длине отрезков флюоресцентномеченой ДНК в любой полосе электрофоретического разделения.