Другой путь выделения индивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНК взаимо­действовать с комплементарными ДНК, связанными с твердым носи­телем (целлюлоза, сефароза, нитроцеллюлозные фильтры). Этот ме­тод отбора и очистки специфических мРНК является самым эффективным. Однако его применение возможно только при наличии соответст­вующих комплементарных ДНК.

Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к ра­ботам по синтезу гена с помощью обратной транскрипции, которую осуществляют с помощью ревертазы AMV в специально подобран­ных условиях. В процессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК, а затравкой олиго(dT12-18) (для мРНК, имеющих поли(А)-тракт) или химически синтезированный олигонуклеотид, комплемен­тарный 3'-концу мРНК. После синтеза на мРНК компле­ментарной цепи ДНК и разрушения РНК (чаще используется обра­ботка щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. В этой реакции матрицей служит первая цепь ДНК. Реакция может катали­зироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой.

После получения двухцепочечной кДНК следует стадия получения гена, заключающаяся в гидролизе одноцепочечного участка ДНК, соединяющего первую и вторую цепи, нуклеазой S1.

Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов: 1) расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданном месте; 2) синтез РНК (ферментативный на ДНК- или РНК-матрицах и химический).

Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в присутствии различных ферментов. Для этой цели используют ферменты: рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно связанные с олигонуклеотидами (например, стафилококковая нуклеаза), рибозимы (например, рибозим L-19).

Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК (называемой также адресованной, сайт-направленной или сайт-специфической фрагментацией РНК) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК ферментом РНКазой H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов. Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фрагментации РНК.

Метод основан на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса. К участку РНК, по которому планируется провести ее фрагментацию, синтези­руется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатков. Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК, который затем обрабатывают ферментом. В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент, который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных примесей. Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК, а также для иден­тификации продуктов процессинга некоторых РНК.

Важным достоинством рассматриваемого метода является и то, что в результате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фраг­менты, у одного из которых на 5'-конце содержится фосфатная группа, а у другого 3'-конец свободен (нефосфорилирован). Такие фрагменты можно прямо использо­вать в реакции ферментативного лигирования.

Серьезным ограничением этого метода является то, что участок РНК, с которым связывается комплементарный ему олигодезоксири­бонуклеотид, должен иметь однотяжевую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК, представляющей собой в усло­виях расщепления компактную глобулу с развитой вторичной струк­турой. В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть, ис­пользуя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные), которые предварительно отжигают с частично или полно­стью денатурированной РНК.

Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том, что в общем случае предсказать, какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе (или в непосредственной близости от него) подвергнется расщеплению, не удается. Более того, фермент зачастую гидролизует не одну, а несколько соседних межнуклеотидных связей. Ясно, что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такие фрагменты могут оказаться непригодными.

Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз, ковалентно связанных с олигонуклеотидами. Идея, лежащая в основе данного подхода к направленной фрагментации РНК, восходит к концу 60-х годов, когда Н. И. Гриневой и ее сотрудниками был предложен метод олигонуклеотид-направляемой модификации нуклеиновых кислот. Принцип этого метода заключается в том, что с 5'- или 3'-концевым остатком олигонуклеотида, комплементарного заданному району ДНК и РНК, связывают модифицирующий агент, который после образования дуплекса атакует одно из ближайших к нему оснований. Реагентами этого типа удалось направленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей, РНК-компонент (M1 РНК) РНКазы Р, а также 16S рибосомную РНК E.coli.

Однако, как и в случае РНКазы Н, расщепление РНК олигонуклеотид-нуклеазой зачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям, что несколько ограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантных РНК.

Для расщепления РНК применяют также рибозимы (природные РНК и синтетические полирибонуклеотиды, способные катализировать целый ряд превращений у других РНК). Первый рибозим, напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции, был получен Т. Чеком. В научной литературе его обозна­чают как рибозим L-19. Этот рибозим представляет собой РНК длиной в 395 нуклеотидных остатков, в 5'-концевой области которой имеется гексануклеотидная последовательность GGAGGG, ответст­венная за специфичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге. Эта последовательность комплементарна CUCUCU последовательности, расположенной на 3'-конце первого экзонного участка предшественника 26S РНК. Если эту РНК заменить другой, но обязательно содержащей доступную для комплементарного связывания CUCUCUA последовательность, то рибозим L-19 в присутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов со свободной 3'-гидроксильной группой расщепит ее.

Источником необходимых участков РНК может служить такой способ, как синтез фрагментов РНК. Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использованием разнообразных генно-инженерных конструкций. Однако в настоящее время в подавляющем большинстве случаев для препаративного получения РНК используются РНК-полимеразы, закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов (Т3, Т7 и SP6). Они характеризуются очень высокой активностью и, в отличие от клеточных РНК-полимераз, состоят из одной полипептидной цепи. Важно также то, что инициация и терминация синтеза РНК этими полимеразами происходит на одном определенном нуклеотидном остатке.

Полученные одним из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшем встраивают в векторные молекулы.

Подводя итог изложенному, можно сделать вывод, что получение генов протективных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу. Однако ее решение необходимо для создания в конечном счете рекомбинантных противовирусных вакцинных препаратов.